Una molécula de anticuerpo anti-CD20 fusionada con IL-2, que comprende:

(i) un polipéptido de región variable de cadena pesada, modificado, que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, pero que incluye, como mínimo, una substitución de residuos de aminoácidos en dicha secuencia, elegida entre el grupo constituido por V12K, M20V, A68T, Q82E, T87R, S91T, D93V, y A114T, (ii) un polipéptido de región variable de cadena ligera, modificado, que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, pero que incluye, como mínimo, una substitución de residuos de aminoácidos en dicha secuencia, elegida entre el grupo constituido por L11I, S12T, A59S, S69T, L72M, R76S, y V77L, y (iii) una región constante de cadena pesada de IgG humana y una región constante de cadena ligera humana

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones polipeptídicas que se enlazan con el antígeno CD20. De una manera más específica, la invención se refiere a composiciones polipeptídicas que se enlazan con el antígeno CD20 humano y a procedimientos para el empleo de las composiciones. Tales composiciones polipeptídicas incluyen anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos y proteínas de fusión de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo con una citocina. FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN

Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmune no deseada con respecto a la proteína terapéutica. Diversos anticuerpos monoclonales de ratón se han mostrado prometedores como terapias para controlar un número de enfermedades humanas pero, en ciertos casos, han fallado como consecuencia de la inducción de grados significativos de una respuesta de anticuerpo humano antimurino (HAMA) (Schroff, R. W. et al. (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. et al. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535). Se ha desarrollado un número de técnicas para los anticuerpos monoclonales en un intento de reducir la respuesta HAMA (WOA8909622; EPA0239400; EPA0438310; WOA9106667; EPA0699755). Los enfoques del ADN recombinante han reducido, en general, la información genética del ratón en el constructo del anticuerpo final mientras que aumentan la información genética humana en el constructo final para dar como resultado moléculas de anticuerpos que se denominan, en general, anticuerpos "humanizados".

Los anticuerpos humanizados son, en su mayor parte, inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que han sido reemplazados residuos de la región hipervariable del receptor por residuos de la región hipervariable, que proceden de especies no humanas (anticuerpo donante) tales como el ratón, la rata, el conejo o los primates, y este proceso se denomina a veces "implante CDR". Por regla general, son reemplazados residuos de la región marco Fv adicional (FR) de la inmunoglobulina humana por residuos correspondientes no humanos y en algunos casos se llevan a cabo otras substituciones para restaurar ulteriormente la función anticuerpo. Los anticuerpos humanizados típicos son reconstituidos en moléculas de anticuerpos completos, que comprenden dos dominios variables, en los cuales todos,

o substancialmente todos, los bucles hipervariables corresponden a los de la inmunoglobulina no humana y todas, o substancialmente todas, las regiones FR son las de la secuencia de la inmunoglobulina humana. Por lo tanto, el anticuerpo humanizado comprenderá, por regla general, como mínimo una porción de una región constante de la inmunoglobulina derivada humana (Fc) (Jones et al. (1986), Nature 321: 522-525; Reichmann et al. (1988), Nature 332: 323-329). No obstante, los anticuerpos humanizados han inducido todavía, en muchos casos, una respuesta inmune en pacientes (Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al. (1999) Transplantation 68: 1417-1420).

La clave de la inducción de una respuesta inmune consiste en la presencia dentro de la proteína de péptidos que puedan estimular la actividad de los linfocitos T por medio de la presentación de moléculas del MHC clase II, que se denominan "epitopos de los linficitos T". Tales epitopos de los linfocitos T se definen, por regla general, como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos que tiene la capacidad de enlazarse con las moléculas del MHC clase II. Implícitamente, un "epitopo de los linfocitos T" significa un epitomo, que puede ser reconocido por un receptor de los linfocitos T (TCR) cuando se enlaza con las moléculas del MHC, y que puede provocar, al menos en principio, la activación de estos linfocitos T, haciendo que un TCR promueva una respuesta de los linfocitos T.

Las moléculas del MHC clase II constituyen un grupo de proteínas altamente polimórficas, que juegan un papel central en la selección y en la activación de los linfocitos T auxiliares. El grupo antígeno de los leucocitos humanos DR (HLA-DR) constituye el isotipo predominante de este grupo de proteínas y los isotipos HLA-DQ y HLA-DP ejercen funciones similares. En la población humana, los individuos portan entre dos y cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos alelos DP. Se ha resuelto la estructura de un número de moléculas DR y estas se presentan como una cisura enlazante peptídica de extremo abierto con un número de bolsillos hidrófugos, que emplean residuos hidrófugos (residuos de bolsillo) de los péptidos (Brown et al.

Nature (1993) 364: 33; Stem et al. (1994) Nature 368: 215). El polimorfismo, que identifica los diferentes alotipos de las moléculas de clase II, contribuye a una amplia diversidad de diferentes superficies de enlace para péptidos dentro de la cisura de enlace peptídica y asegura, al nivel de población, la máxima flexibilidad con respecto a la capacidad para reconocer proteínas foráneas y establece una respuesta inmune a los organismos patógenos.

Una respuesta inmune a una proteína terapéutica se lleva a cabo a través de la vía de presentación de péptidos del MHC clase II. En este caso, las proteínas exógenas son absorbidas y procesadas para la presentación en asociación con moléculas del MHC clase II del tipo DR, DQ o DP. Las moléculas del MHC clase II son expresadas por células presentadoras de antígeno profesionales (APCs), tales como los macrófagos y las células dendríticas entre otras. El empleo de un complejo peptídico del MHC clase II por un receptor afín de los linfocitos T sobre la superficie de los linfocitos T, junto con la reticulación de otros co-receptores determinados tales como la molécula CD4, puede inducir un estado activado dentro de los linfocitos T. La activación conduce a la secreción de citocinas que, a continuación, activan a otros linfocitos tales como los linfocitos B, para que produzcan anticuerpos, o que activan a los linfocitos T agresores como una respuesta inmune celular completa.

La identificación de los epitopos de los linfocitos T es la primera etapa para la eliminación de los epitopos. Los epitopos identificados pueden ser eliminados mediante una substitución juiciosa de aminoácidos o por medio de otras estrategias de modificación. Un enfoque de este tipo ha sido reconocido en las publicaciones WO 98/52976 y WO 00/34317, habiendo sido descritas en el último de los casos técnicas informáticas de fileteado como un medio para llevar a cabo la identificación de las secuencias polipéptidas con el potencial para enlazarse con un subjuego de alotipos DR humanos del MHC clase II y se eliminan los epitopos previstos de los linfocitos T por substitución de aminoácidos dentro de la proteína de interés.

Sería deseable identificar y eliminar, o al menos reducir, los epitopos de los linfocitos T a partir de un determinado péptido, de un determinado polipéptido o de una determinada proteína, que, en principio, son terapéuticamente valiosos, pero que originalmente son inmunógenos. Una de estas moléculas terapéuticamente valiosas es un anticuerpo monoclonal, con especificidad de enlace para el antígeno CD20 de los linfocitos B humanas. Los anticuerpos monoclonales preferentes de la presente invención son formas modificadas de los anticuerpos 2B8 y Leu16. El anticuerpo 2B8 está descrito en la patente norteamericana U.S. No. 5,736,137, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. El anticuerpo Leu16 está descrito en la publicación de los autores Wu et al. Protein Engineering (2001) 14:1025-1033. La publicación WO 02/069232 divulga algunas formas modificadas del anti-CD20 mAb c2B8 quimérico.

La CD20 es una fosfoproteína no glicosilada de 35,000 Daltons, que de forma típica se denomina antígeno de diferenciación restringido de los linfocitos B humanos Bp35B. La proteína es una molécula de superficie altamente específica para la células, que es expresada en los linfocitos pre-B y en los linfocitos B maduros, que incluyen más de un 90 % de linfocitos B de linfomas no hodgkinianos (NHL). Los anticuerpos monoclonales y los radioinmunoconjugados selectivos para el CD20 han emergido como nuevos tratamientos para los NHL. El ejemplo más significativo incluye el anticuerpo parental de la presente invención, concretamente el anticuerpo monoclonal 2B8 (Reff, M.E. et al. (1994) Blood 83: 435-445). Los dominios de región variable del 2B8 han sido clonados y combinados con dominios de región constante humanos para producir un anticuerpo quimérico, que se denomina C2B8 que está comercializado como RITUXAN™ en los Estados Unidos de América...

1. Una molécula de anticuerpo anti-CD20 fusionada con IL-2, que comprende:

(i) un polipéptido de región variable de cadena pesada, modificado, que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, pero que incluye, como mínimo, una substitución de residuos de aminoácidos en dicha secuencia, elegida entre el grupo constituido por V12K, M20V, A68T, Q82E, T87R, S91T, D93V, y A114T,

(ii) un polipéptido de región variable de cadena ligera, modificado, que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, pero que incluye, como mínimo, una substitución de residuos de aminoácidos en dicha secuencia, elegida entre el grupo constituido por L11I, S12T, A59S, S69T, L72M, R76S, y V77L, y

(iii) una región constante de cadena pesada de IgG humana y una región constante de cadena ligera humana. 2. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20 de la reivindicación 1, en

la que la región constante de la IgG es una región constante de la IgG1 humana.

3. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20 de la reivindicación 1 o 2, en la que la región constante de cadena ligera humana es una región constante de cadena ligera kappa humana.

4. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una región variable de cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

5. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una región variable de cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

6. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una región variable de cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

7. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con

- 42 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el extremo C de la molécula de anticuerpo está fusionado con el extremo N de la IL-2. 8. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con la reivindicación 1, codificada por las secuencias de ADN de la SEQ NO: 40 y de la 5 SEQ NO:43. 9. Una composición farmacéutica, que comprende una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con un soporte, un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable. 10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que comprende, 10 además, un fármaco adicional farmacológicamente efectivo. 11. Una molécula de ADN, que codifica una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 12. Uso de una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de una composición farmacéutica de la reivindicación 9 o 15 10, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de cánceres que expresan CD20. 13. Uso de la reivindicación 12, en el que dicho cáncer es un linfoma de los linfocitos B. 14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de 20 anticuerpo anti-CD20 de la reivindicación 8 y rituximab de anticuerpo monoclonal. 15. Una proteína de fusión de anticuerpo anti-CD20, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para el uso en el tratamiento de cánceres que expresan CD20. Siguen veintitrés hojas de dibujos.