Anticuerpos contra el factor VIII con glucosilación modificada en la región variable.

Un anticuerpo inhibidor modificado contra el Factor VIII (FVIII) o su fragmento de unión a antígeno,

- en el que el anticuerpo inhibidor no modificado comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de lacadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 64, 79 a 95y 128 a 145 de SEC ID NO:2, respectivamente, y comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de lacadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 44 a 55, 71 a 77 y110 a 119 de SEC ID NO:4, respectivamente, y

- en el que el anticuerpo inhibidor no modificado se produce mediante expresión en una estirpe celular delinfoblastoide humano, caracterizada por que dicha modificación es una desglucosilación total o parcial en laposición Asn 47 de SEC ID NO:2 en la secuencia de consenso de glucosilación de la cadena pesadavariable, y en el que el anticuerpo no modificado tiene una actividad inhibidora disminuida frente al Factor VIIIen comparación con el anticuerpo inhibidor no modificado.

Anticuerpos contra el factor VIII con glucosilación modificada en la región variable

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la modificación de anticuerpos inhibidores a fin de lograr una actividad inhibidora máxima variable, y a su aplicación en el desarrollo de agentes antitrombóticos, así como a composiciones farmacéuticas y mezclas que incluyen tales anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La formación de coágulos de sangre no sólo limita la hemorragia en caso de lesión (hemostasia) sino que puede ocluir importantes arterias o venas, conduciendo al grave daño orgánico y a la muerte. De este modo, la trombosis es la formación de coágulos de sangre en el momento y lugar equivocados.

Con el daño de un vaso, el sistema de coagulación (coagulante) se inicia inmediatamente, produciendo trombina y plaquetas sanguíneas que se adhieren a proteínas de la matriz, lo que a su vez conduce a la agregación de plaquetas adicionales en un tapón de plaquetas creciente concomitantemente con la conversión de fibrinógeno en la sangre a la fibrina insoluble.

En cada etapa del ciclo de coagulación, un cimógeno de un factor de coagulación sufre proteolisis limitada y se convierte él mismo en una proteasa activa. Esta enzima del factor de coagulación activa al siguiente cimógeno del factor de coagulación hasta que se forma trombina, que conecta fibrinógeno al coágulo de fibrina insoluble. Los factores de coagulación de la sangre incluyen factor I (fibrinógeno) , factor II (protrombina) , factor tisular (anteriormente conocido como factor III) , factor IV (Ca2+) , factor V (factores lábiles) , factor VII (proconvertina) , factor VIII (globulina antihemofílica, o 11AHG11) , factor IX (factor de Christmas) , factor X (factor de Stuart) , factor XI (antecedente de la tromboplastina plasmática, o “PTA”) , factor XII (factor de Hageman) , factor XIII (factor estabilizante de la fibrina) , y factores HMWK (quininógeno de peso molecular elevado, o factor de Fitzgerald) , PREK (precalicreína, o factor de Fletcher) , Ka (calicreína) , y PL (fosfolípido) .

El fibrinógeno es un sustrato para la enzima trombina (factor IIa) , una proteasa que se forma durante el proceso de coagulación mediante la activación de un cimógeno circulante, la protrombina (factor II) . La protrombina se convierte en la enzima activa trombina por el factor X activado, en presencia de factor V activado, Ca 2+ y fosfolípido. Dos rutas distintas, denominadas los sistemas “intrínseco” y “extrínseco”, conducen a la formación de factor X activado. En el sistema intrínseco, están presentes todos los factores proteicos necesarios para la coagulación en la sangre circulante. En el sistema extrínseco, el factor tisular, que no está presente en la sangre circulante, se expresa en endotelio dañado, por monocitos activados, por células en la placa arteriosclerótica, o por células fuera de la pared de los vasos. El factor tisular actúa entonces como el receptor y cofactor esencial para la unión del factor VII, dando como resultado una enzima bimolecular (factor tisular VIIa) para iniciar la ruta extrínseca de la coagulación. Este mecanismo también activa la ruta intrínseca de la coagulación.

Como resumen, el sistema de coagulación implica una cascada de reacciones bioquímicas complejas y reguladas entre proteínas sanguíneas circulantes (factores de coagulación) , células de la sangre (en particular plaquetas) y elementos de una pared de vaso lesionada.

La enfermedad tromboembólica venosa (trombosis de venas profundas, embolia pulmonar, fibrilación ventricular) sigue siendo un problema importante de salud, con una incidencia de 1 a 3 por 1000 individuos por año, y una tasa de mortalidad prematura elevada (Nordstrom et al. (1992) J Intern Med. 232, 155-160; Rosendaal (1997) Thromb Haemost 78, 1-6) .

Las terapias anticoagulantes actuales consisten principalmente en heparina (o heparinas de peso molecular bajo) y antagonistas de la vitamina K, que son ambos insatisfactorios e inconvenientes. Todos los tratamientos poseen un riesgo significativo de hemorragia (Res. Comm. British Thoracic Soc. (1992) Lancet. 340 (8824) :873-6) , lo que limita tanto la dosis como la duración del tratamiento y puede requerir una monitorización habitual (Hylek y Singer (1994) Ann Intern Med. 120, 897-902; Cannegieter et al. (1995) N Engl J Med. 333, 11-17) . Actualmente se están desarrollando nuevos fármacos, pero ninguno parece adecuarse a los criterios óptimos de eficacia, seguridad y conveniencia.

Los anticuerpos dirigidos contra factores de coagulación se desarrollaron recientemente como agentes anticoagulantes. Ya se han descrito anticuerpos dirigidos contra Factor IX, Factor IXa, Factor X, Factor Xa, Factor XI, factor XIa, Factor VIII, Factor VIIIa, Factor V, Factor Va, Factor VII, Factor VIIa, trombina, el Factor de Von Willebrand, el Factor tisular, y otros elementos del ciclo de coagulación.

El documento WO 97/26010 describe anticuerpos que inhiben la coagulación en lo que se describe como “una manera autolimitada”. Estos anticuerpos se caracterizan por el hecho de que concentraciones elevadas de tales anticuerpos prolongan los ensayos de coagulación, tal como el APTT, sólo de una manera limitada, y no harán incoagulable a la sangre, en contraste con dosis elevadas de agentes anticoagulantes tales como la heparina. Sin embargo, un incremento limitado en APTT no excluye el riesgo de hemorragia. Ahora se ha demostrado que estos anticuerpos que tienen una denominada “actividad neutralizante autolimitante” pueden evitar neutralizar completamente su factor de coagulación diana, exponiendo de ese modo al paciente a riesgos de hemorragia elevados. De hecho, en pacientes con deficiencia total de factores de coagulación tales como FVIII o FIX, APTT también se prolonga de una manera sólo finita. La sangre de tales pacientes es también no incoagulable, en contraste con la sangre tratada con dosis elevadas de heparina. Sin embargo, tales pacientes con deficiencia grave de FVIII o FIX sufren enfermedades hemorrágicas dramáticas, denominadas hemofilia A o B. Puesto que los anticuerpos que inhiben factores de coagulación de una “manera autolimitada” tienen actividades biológicas que imitan al defecto de la sangre de sus pacientes, pueden exponer a los pacientes a riesgos elevados de hemorragia.

El documento WO 01/04269 describe un anticuerpo monoclonal humano, Krix-1, que sólo inhibe parcialmente la actividad de FVIII cualquiera que sea el exceso (molar) de anticuerpo con respecto a FVIII. Esta inactivación limitada de FVIII se denominó un “efecto meseta”. Por comparación con anticuerpos que tienen “actividad neutralizante autolimitante”, los anticuerpos tales como Krix-1 tienen la ventaja de que no pueden inactivar completamente el factor de coagulación diana. El documento WO 01/04269 A1 describe que, a pesar de esta inactivación limitada de FVIII, Krix-1 fue eficaz previniendo la trombosis en un modelo de hámster de trombosis venosa. Este anticuerpo también fue eficaz en un modelo de ratón de trombosis de vena cava (Singh et al. (2002) Blood 99, 3235-3240.) . Krix-1 inhibe alrededor del 90% de la actividad de FVIII (intervalo 85-95%) en plasma humano normal. La publicación de Singh describe además un anticuerpo monoclonal humano mAb-LE2E9 que inactiva parcialmente el factor VIII (FVIII) humano, conduciendo a aproximadamente 10% de actividad residual. No aparecieron trombos en ratones de tipo salvaje tratados con mAb-LE2E9. El tratamiento con mAb-LE2E9 tampoco da como resultado un fenotipo de hemorragia grave.

Por lo tanto, el factor FVIII parece una diana potencial para fármacos anticoagulantes. Sin embargo, es probable que la tendencia a la hemorragia asociada con el uso de anticuerpos anti-FVIII estará relacionada con el grado de inhibición del factor de coagulación diana. Por lo tanto, es importante establecer métodos para generar preparaciones de anticuerpos con una relación óptima entre eficacia (acción antitrombótica) y seguridad (baja tendencia a la hemorragia) .

Hasta ahora, todos los agentes anticoagulantes ensayados en estudios clínicos están asociados con un riesgo importante de hemorragia. Además, LMWH requiere administraciones subcutáneas frecuentes, y los derivados de cumarina requieren una monitorización habitual.

Por lo tanto, son deseables métodos más seguros y más eficientes para la prevención y tratamiento de enfermedades tromboembólicas venosas. Los agentes anticoagulantes ideales no deberían plantear un riesgo de complicaciones hemorrágicas o de sobredosificación. No deberían necesitar una monitorización habitual, deberían ser... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo inhibidor modificado contra el Factor VIII (FVIII) o su fragmento de unión a antígeno,

- en el que el anticuerpo inhibidor no modificado comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 64, 79 a 95 y 128 a 145 de SEC ID NO:2, respectivamente, y comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 44 a 55, 71 a 77 y 110 a 119 de SEC ID NO:4, respectivamente, y

- en el que el anticuerpo inhibidor no modificado se produce mediante expresión en una estirpe celular de linfoblastoide humano, caracterizada por que dicha modificación es una desglucosilación total o parcial en la posición Asn 47 de SEC ID NO:2 en la secuencia de consenso de glucosilación de la cadena pesada variable, y en el que el anticuerpo no modificado tiene una actividad inhibidora disminuida frente al Factor VIII en comparación con el anticuerpo inhibidor no modificado.

2. El anticuerpo o el fragmento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de consenso de glucosilación en las posiciones 47 a 49 de SEC ID NO: 2 está mutada por una mutación de Asn en la posición 47 de SEC ID NO: 2 en cualquier aminoácido y/o un cambio de Thr en la posición 49 de SEC ID NO: 2 en cualquier otro aminoácido diferente de serina.

3. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 2, en el que la mutación es el cambio de Asn en la posición 47 de SEC ID NO: 2 a Gln, Glu o Asp, y/o en el que la mutación es el cambio de Thr en la posición 49 de SEC ID NO: 2 a Ala.

4. El anticuerpo o el fragmento según la reivindicación 1, en el que la desglucosilación completa o parcial es una desglucosilación de Asn en la posición 47 de SEC ID NO: 2.

5. El fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un fragmento scFv, un fragmento Fab o un fragmento F (ab’) 2.

6. El fragmento según la reivindicación 5, en el que el fragmento scFv está representado por los aminoácidos 21 a 282 de SEC ID NO: 26.

7. El anticuerpo o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo inhibidor no modificado contra FVIII tiene una secuencia de cadena pesada variable como se representa mediante los aminoácidos 20 a 165 de SEC ID NO: 2, y una secuencia de cadena ligera variable como se representa mediante los aminoácidos 21 a 143 de SEC ID NO: 4.

8. El anticuerpo o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo inhibidor no modificado contra FVIII es el anticuerpo como se obtiene a partir de la estirpe celular Krix-1 depositada como LMBP 5089CB.

9. Una mezcla de:

- el anticuerpo inhibidor modificado o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y

- el anticuerpo inhibidor no modificado o su fragmento de unión a antígeno, que comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 64, 79 a 95 y 128 a 145 de SEC ID NO: 2, respectivamente, y que comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 44 a 55, 71 a 77 y 110 a 119 de SEC ID NO: 4, respectivamente, y cuyo anticuerpo inhibidor no modificado o su fragmento de unión a antígeno se produce mediante expresión en una estirpe celular de linfoblastoide humano.

10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o su fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o que comprende la mezcla según la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una mezcla según la reivindicación 9, para tratar o prevenir un trastorno tromboembólico, incluyendo, pero sin limitarse a, la prevención de trombosis de venas profundas, embolia pulmonar como consecuencia de intervención quirúrgica, o trombofilia hereditaria crónica,

o trombofilia adquirida, y tratar trombosis de venas profundas, embolia pulmonar, apoplejía, fibrilación ventricular, infarto de miocardio no de onda Q, infarto de miocardio elevado no ST, angina inestable, septicemia o SIRS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica) .

12. Uso de un anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una mezcla según la reivindicación 9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno tromboembólico, incluyendo, pero sin limitarse a, prevención de la trombosis de venas profundas, embolia pulmonar como consecuencia de intervención quirúrgica, o trombofilia hereditaria crónica, o trombofilia adquirida, y para el

tratamiento de trombosis de venas profundas, embolia pulmonar, apoplejía, fibrilación ventricular, infarto de miocardio no de onda Q, infarto de miocardio elevado no ST, angina inestable, septicemia o SIRS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica) , en el que dicho medicamento comprende además, para administración concomitante, un fármaco o fármacos para inhibir la agregación plaquetaria, tal como aspirina.

13. El uso según la reivindicación 12, para el tratamiento de un infarto de miocardio agudo, en el que dicho medicamento comprende además, para administración concomitante, un fármaco o fármacos para inhibir la agregación plaquetaria, tal como abciximab, o comprende además un agente trombolítico, tal como activador de plasminógeno tisular, estafilocinasa o microplasmina.

14. Un método in vitro para obtener una librería de al menos dos anticuerpos inhibidores contra el factor VIII con actividad inhibidora máxima variable, comprendiendo dicho método las etapas de:

- proporcionar un anticuerpo inhibidor glucosilado contra FVIII o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 64, 79 a 95 y 128 a 145 de SEC ID NO: 2, respectivamente, y comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 44 a 55, 71 a 77 y 110 a 119 de SEC ID NO: 4,

- modificar la glucosilación de Asn en la posición 47 de SEC ID NO: 2, y

- seleccionar al menos un anticuerpo o fragmento que tiene una actividad inhibidora máxima diferente.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además la etapa de seleccionar aquellos anticuerpos o fragmentos para los cuales la afinidad no se ve sustancialmente afectada.

16. Un método in vitro para producir un anticuerpo inhibidor contra FVIII o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibiendo dicho anticuerpo o fragmento a FVIII entre 20 y 85% a concentración saturante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, comprendiendo dicho método las etapas de:

- proporcionar un anticuerpo inhibidor intacto contra FVIII o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y que comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 64, 79 a 95 y 128 a 145 de SEC ID NO: 2, respectivamente, y comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 44 a 55, 71 a 77 y 110 a 119 de SEC ID NO: 4,

- modificar la glucosilación en Asn en la posición 47 de SEC ID NO: 2,

- evaluar la capacidad de dicho anticuerpo inhibidor modificado o de dicho fragmento para inhibir FVIII entre 20 y 85% a concentración saturante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

17. Una mezcla que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y que comprende otro anticuerpo que es un anticuerpo inhibidor contra FVIII.

18. La mezcla según la reivindicación 17, en la que dicho otro anticuerpo es el anticuerpo que comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 45 a 54, 69 a 85 y 118 a 128 de SEC ID NO: 30, respectivamente, y comprende como regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos representadas por los aminoácidos 42 a 52, 68 a 74 y 106 a 116 de SEC ID NO: 32, respectivamente.

19. La mezcla según la reivindicación 9, 17 ó 18, en la que dichos anticuerpos se mezclan juntos en una relación apropiada para lograr una inhibición máxima dada de la actividad de FVIII, cualquiera que sea el exceso de la mezcla de anticuerpos con respecto a FVIII.

20. Una composición farmacéutica que comprende la mezcla según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.