ANTICUERPOS LIGANTES AL MAGIC ROUNDABOUT (MR) HUMANO, POLIPÉPTIDOS Y SU USO PARA LA INHIBICIÓN DE ANGIOGÉNESIS.

Uso de un anticuerpo que se liga selectivamente a residuos de aminoácidos 46 a 209 del magic roundabout (MR) humano (SEQ ID NO:

2) en la preparación de una medicina para inhibir angiogénesis

Anticuerpos ligantes al Magic Roundabout (MR) humano, polipéptidos y su uso para la inhibición de angiogénesis.

La presente invención se refiere a anticuerpos y polipéptidos, y en particular a los anticuerpos y polipéptidos ECSM4 que inhiben los angiogénesis y su uso para ello.

Las células endoteliales forman una única capa celular que reviste todos los vasos sanguíneos y regula los intercambios entre la corriente sanguínea y los tejidos circundantes. Nuevos vasos sanguíneos se desarrollan desde las paredes de pequeños vasos ya existentes por la protuberancia de estas células endoteliales que tienen la capacidad de formar tubos capilares huecos incluso cuando aisladas en cultivo. In vivo, los tejidos deteriorados y algunos tumores atraen un abastecimiento de sangre segregando factores que estimulan las células endoteliales cercanas a que construyan nuevos brotes capilares. Los tumores que no logran atraer un abastecimiento de sangre están severamente limitados en su crecimiento.

El proceso por el cual se originan nuevos vasos como capilares, creciendo desde pequeños vasos ya existentes, se llama angiogénesis. Por consiguiente, se puede notar que la angiogénesis desempeña un papel importante en el crecimiento y la reparación normal del tejido y en la evolución de varias condiciones patológicas.

Una vez que el sistema vascular está totalmente desarrollado, las células endoteliales de los vasos sanguíneos se suelen mantener inactivas, con ninguna nueva formación de vasos, con la excepción de la formación de nuevos vasos sanguíneos en caso de la curación normal de heridas. Sin embargo, una desregulación en el crecimiento de un vaso sanguíneo y un incremento anormal de la densidad del vaso pude suceder en enfermedades o condiciones tales como tumorigénesis, retinopatía diabética, psoriasis e inflamación. Por consiguiente, la aptitud para inhibir angiogénesis inapropiada o indeseable puede ser útil en el tratamiento de estas enfermedades o condiciones.

El anticuerpo Magic Roundabout humano (MR también conocido como molécula específica 4 de célula endotelial, ECSM4) demostró anteriormente que tiene un perfil de expresión selectiva alta de célula endotelial (Huminiecki y Bicknell 2000), Genome research, 10, 1796-1808; y WO 02/36771). Se demostró que la expresión MR in vivo está restringida a lugares de angiogénesis activa, en particular en los vasos con tumor.(Humimiecki et al. (2002) Genomics, 79(4), 547-552).

Basado en esta información, se sugirió en WO 02/36711 que los compuestos incluyendo una fracción que liga el MR, tal como un anticuerpo, y una fracción funcional más, pueden ser útiles para una variedad de objetivos médicos incluyendo representar mediante imagen el epitelio vascular, diagnosticar o pronosticar una condición involucrando el epitelio vascular; evaluar la eficacia de terapias anti-angiogénicas; detectar daño endotelial; detectar un tumor o neovasculatura tumoral o enfermedad cardíaca o endometriosis o ateroesclerosis; tratar una enfermedad proliferativa que afecta al endotelio vascular tal como cáncer, psoriasis, retinopatía diabética, arterosclerosis o menorragia; introducir material genético en las células endoteliales vasculares; y modular la angiogénesis.

Por ejemplo, WO 02/36771 enseña un compuesto que comprende una fracción que liga al MR, tal como un anticuerpo, y una fracción más tal como un inhibidor de angiogénesis (página 27). WO 02/36771 enseña también un compuesto incluyendo una fracción que liga a MR, tal como un anticuerpo, y una fracción más tal como una fracción citotóxica que destruye o retrasa o da marcha atrás al crecimiento de la neovasculatura. (página 35).

Sin embargo, en cada caso, la fracción que liga a MR conduce sencillamente la fracción funcional a una localización endotelial deseada para su uso. WO 02/36771 no propone que la fracción que liga a MR sea ella misma funcional, ni menos que inhiba el MR o pueda ser utilizada para inhibir la angiogénesis.

Ahora, hemos demostrado que un anticuerpo que se liga selectivamente a la región extracelular de MR resulta en una inhibición de angiogénesis.

En el párrafo que comprende las páginas 71-72, WO 02/36771 expone que ambos anticuerpos que estimulan o activan MR y anticuerpos que evitan estimulación y activación de MR podrían ser utilizados para modular la angiogénesis. Sin embargo, esto no propone que un anticuerpo que selectivamente liga a la región extracelular de MR pueda ser utilizado para inhibir angiogénesis. Además, en el mejor conocimiento de la invención, ni WO 02/36771, ni otro documento prueban que un anticuerpo que liga selectivamente a la región extracelular de MR, de hecho inhibe la angiogénesis.

De este modo se ha facilitado conforme a un primer aspecto de la invención el uso de un anticuerpo que liga selectivamente a residuos 46-209 de un Magic Roundabout (MR) humano en la preparación de un medicamento para inhibir angiogénesis.

Con "Inhibir angiogénesis" entendemos la reducción de la tasa o nivel de angiogénesis. La reducción puede ser de un bajo nivel alrededor de 10%, o alrededor de 20%, o de 30%, o de 40% de la tasa o nivel de angiogénesis. De manera preferible, la reducción es de nivel medio de un 50%, o de 60%, o de 70%, o de 80% de la tasa o del nivel de la angiogénesis. De manera más preferible, la reducción es de un alto nivel de un 90%, o de un 95%, o de un 99%, o de un 99,9%, o de un 99,99% de la tasa o del nivel de la angiogénesis. De la manera más preferible, la inhibición también puede incluir la eliminación de angiogénesis o su reducción a un nivel indetectable.

Los métodos y pruebas para determinar la tasa o el nivel de angiogénesis, y por lo tanto para determinar si y en qué alcance un anticuerpo inhibe la angiogénesis, son conocidos en la técnica.

Por ejemplo la patente estadounidense No. 6, 225,118 B1 a Grant et al describe una prueba multicelular in vitro para modelar las etapas combinadas de la angiogénesis, en concreto las etapas de proliferación, migración, y diferenciación del desarrollo de una célula.

El angioKit, catálogo No. ZHA-1000, de TCS Cell Works Ltd, Buckingham, MK 18 2LR, UK, es un modelo de angiogénesis humana adecuado para analizar las propiedades angiogénicas o anti-angiogénicas de los compuestos de ensayo.

La tasa o el nivel de angiogénesis también puede ser determinado usando la prueba del anillo aórtico descrita en el ejemplo 2.

De manera preferible, el anticuerpo inhibe también el angiogénesis in vivo, especialmente en los mamíferos, y más preferible en los humanos.

Con MR, incluimos el producto genético del gen Mágico Roundabout Humano (también conocido como ECSM4) y las variantes que ocurren naturalmente. El cDNA y la secuencia aminoácida del MR se encuentran en Genbank Accession Nos. AF361473 y AAL31867 y se pueden ver en la figura 1 (SEQ ID Nos: 1 y 2, respectivamente).

MR es una proteína transmembrana y ha sido pronosticado que tiene una región extracelular en residuos 1-467 (SEQ ID NO: 3), una región transmembrana en residuos 468-490 y una región intracelular en residuos 491-1007 (Huminiecki et al. 2002). La región extracelular de MR tiene una región inmunoglobulina(lg) en residuos 46-209 (SEQ ID NO: 4), que puede subdefinirse más en un dominio lgA en residuos 46-116 (SEQ ID NO: 5), y un dominio igB en residuos 151-209 (SEQ ID NO: 6), y dos dominios de fibronectina tipo III en residuos 252-335 (SEQ ID NO: 7), y 347-432 (SEQ ID NO: 8). La numeración de los residuos aminoácidos de MR son los dados en AF 361473, AAL31867 y en la figura 1B.

Por un anticuerpo que "liga selectivamente" a un dominio o región específico de MR, tal un dominio lg, incluimos el sentido que el anticuerpo liga al dominio específico con una mayor afinidad que para cualquier otra región de MR. De manera preferible, el anticuerpo liga al dominio específico de MR con al menos 2, 5, 10, o 50 veces más afinidad que con otra región de MR. De manera más preferible, el anticuerpo liga al dominio específico de MR con al menos 100, 1000, 10000 veces mejor afinidad que con cualquier otra región de MR. Tal vínculo puede ser determinado por métodos muy conocidos en la técnica. De manera preferible, el anticuerpo liga selectivamente a un epítopo dentro de MR y no liga con otros epítopos.

De manera preferible, cuando el medicamento... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo que se liga selectivamente a residuos de aminoácidos 46 a 209 del magic roundabout (MR) humano (SEQ ID NO: 2) en la preparación de una medicina para inhibir angiogénesis.

2. Método in vitro de inhibición de angiogénesis que comprende la administración de un anticuerpo que se liga selectivamente a residuos aminoácidos 46 a 209 del MR humano (SEQ ID NO: 2) a un tejido o células in vitro.

3. Método o uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo se liga selectivamente a los residuos 46 a 116 del MR humano, o a los residuos 151 a 209 del MR humano.

4. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo tiene al menos una región variable de cadena ligera incorporando los CDR siguientes:

5. Método o uso según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo tiene al menos una región variable de cadena ligera incluyendo la secuencia de ácidos aminados.

6. Método o uso según cualquier de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo tiene al menos una región variable de cadena pesada incluyendo los CDR siguientes:

7. Método o uso según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo tiene al menos una región variable de cadena pesada conteniendo la secuencia de ácidos aminados

8. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el anticuerpo tiene al menos una región variable de cadena ligera como definida en la reivindicación 4 o 5 y al menos una región variable de cadena pesada como definida en la reivindicación 6 o 7.

9. Uso de un polinucleótido codificando un anticuerpo como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.

10. Método in vitro de inhibición de la angiogénesis, que comprende la administración de un polinucleótido codificando un anticuerpo como definido en cualquier de las reivindicaciones 1 a 8 a un tejido o a células in vitro.

11. Un anticuerpo que se liga selectivamente a los residuos de aminoácidos 46 a 209 del MR humano (SEQ ID NO: 2) y que contiene las secuencias de ácidos aminados i) a iii), las secuencias de ácidos aminados iv) a vi) o las secuencias de ácidos aminados i) vi):

en donde las secuencias de ácidos aminados i) a iii) corresponden a CDR1, CDR2, CDR3, respectivamente, de una región variable de cadena ligera y las secuencias de ácidos aminados iv) a vi) corresponden a CDR1, CDR2, CDR3, respectivamente, de una región variable de cadena pesada.

12. Un anticuerpo según la reivindicación 11 teniendo al menos una región variable de cadena ligera incorporando los CDR siguientes:

13. Un anticuerpo según la reivindicación 12 teniendo al menos una región variable de cadena ligera conteniendo la secuencia de ácidos aminados

14. Un anticuerpo según la reivindicación 11 teniendo al menos una región variable de cadena pesada incorporando los CDR siguientes:

15. Un anticuerpo según la reivindicación 14, teniendo al menos una región variable de cadena pesada conteniendo la secuencia de ácidos aminados.

16. Un anticuerpo según la reivindicación 11 teniendo al menos una región variable de cadena ligera según la reivindicación 12 o 13 y al menos una región variable de cadena pesada según la reivindicación 14 o 15.

17. Un anticuerpo que se liga selectivamente al epítopo de MR ligado por un anticuerpo teniendo al menos una región variable de cadena ligera kappa según la reivindicación 13 y al menos una región variable de cadena pesada según la reivindicación 15.

18. Un polinucleótido codificando un anticuerpo según cualquier de las reivindicaciones 11 a 17.

19. Un polinucleótido según la reivindicación 18, conteniendo una o varias de las secuencias nucleótidas:

20. Un polinucleótido según la reivindicación 18 o 19 que contiene la secuencia nucleótida

y/o

comprendiendo la secuencia nucleótida

21. Un anticuerpo que se liga selectivamente a los residuos 46 a 209 del MR humano (SEQ ID NO: 2) pero que no se liga selectivamente a los péptidos LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO: 2) o LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO: 29).

22. Un anticuerpo según la reivindicación 21, que se liga selectivamente a los residuos 46 a 116 del MR humano (SEQ ID NO: 2) pero que no se liga selectivamente al péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO: 28), o que se liga selectivamente a los residuos 151 a 209 del MR humano (SEQ ID NO: 2) pero que no se liga selectivamente al péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO 29).

23. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo según la reivindicación 21 o 22.

24. Un compuesto que comprende un anticuerpo según cualquier de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22 y una fracción directamente o indirectamente citotóxica.

25. Compuesto según la reivindicación 24, en donde el grupo citotóxico es seleccionado entre un agente químico-terapéutico directamente citotóxico, un polipéptido directamente citotóxico, una fracción que es capaz de convertir un profármaco relativamente no-tóxico en un fármaco citotóxico, un radiosensor, un ácido nucleico directamente citotóxico, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido directamente o indirectamente citotóxico, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico, o un átomo radioactivo.

26. Un compuesto según la reivindicación 25 en donde el átomo radioactivo es cualquiera entre el fósforo 32, el iodo 125, el iodo 131, el indio 111, el renio 186, el renio 188 o el ytrio 90.

27. Un compuesto según la reivindicación 24 o 25, en el cual el anticuerpo y la fracción citotóxica son polipéptidos que están fusionados.

28. Un polinucleótido codificando un compuesto según la reivindicación 27.

29. Un compuesto que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22 y una fracción fácilmente detectable.

30. Un compuesto según la reivindicación 29 en el cual la fracción fácilmente detectable contiene una cantidad apropiada de cualquiera entre el yodo 123, el yodo 131, el indio 111, el flúor 19, el carbono 13, el nitrógeno 15, el oxígeno 17, el tecnecio 99m, el gadolinio, el manganeso o el hierro.

31. Vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 18, 20, 23, o 28.

32. Una célula huésped que contiene el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o el vector según la reivindicación 31.

33. Una línea de células huéspedes estables produciendo un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22 o un compuesto según la reivindicación 27 resultando de la incorporación en la línea celular de un polinucleótido exógeno según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o un vector según la reivindicación 31.

34. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22, o un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o 29 a 30, y un soporte farmacéutico aceptable.

35. Una composición farmacéutica según la reivindicación 34 adecuada para la administración a un paciente por inyección.

36. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22, o un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o 29 a 30, para un uso médico.

37. Uso de un anticuerpo según cualquier de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22, o de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o de un compuesto según cualquier de las reivindicaciones 24 a 27 o 29 a 30, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.

38. Un método in vitro de inhibición de la angiogénesis, que comprende la administración de un anticuerpo según cualquier de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22, o de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o 29 a 30, a un tejido o células in vitro.

39. Método de producción de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 o 21 a 22, o de un compuesto según la reivindicación 27, el método comprendiendo la expresión de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, 23 o 28, o cultivo de una línea de células huéspedes estables según la reivindicación 33.

40. Uso de un anticuerpo que se liga selectivamente a los residuos a 46 a 209 del MR humano (SEQ ID NO: 2) en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o una afección elegida entre tumores/cáncer, psiorasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo proliferativas y de prematuridad, y retinopatía diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación.

41. Uso del ectodominio de MR (SQ ID NO: 3) o un fragmento de éste que inhibe la migración y/o la proliferación de células endoteliales, o de un polinucleótido codificando el ectodominio de MR o de fragmento de éste que inhibe la migración y/o la proliferación de células endoteliales, en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o afección que implica migración y/o proliferación involuntaria, indeseable o inapropiada de células endoteliales.

42. Uso según la reivindicación 41 en donde la enfermedad o la afección que implica una migración y/o una proliferación involuntaria, indeseable o inapropiada de células endoteliales elegida entre tumores/cáncer, psiorasis, aterosclosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Page, retinopatía y sus complicaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación.

43. Método in vitro de inhibición de migración y/o de proliferación de células endoteliales, que comprende la administración de la ectodominio de MR o de un fragmento de éste que inhibe la migración y/o la proliferación de células endoteliales, de un polinucleótido codificando el ectodominio de MR o de un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o la proliferación de células endoteliales, a un tejido o células in vitro.

44. Uso del ectodominio de MR, o de un fragmento de éste que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.

45. Un uso del ectodominio de MR, o de un fragmento de éste que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o una afección elegida entre tumores/cáncer, psoriasis, un aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo proliferativas y de prematuridad, y retinopatía diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación.

46. Método in vitro de inhibición de la angiogenesis, que comprende la administración del ectodominio de MR, o de un fragmento de éste que inhibe la angiogénesis, a un tejido o células in vitro.

47. El uso de un polinucleótido que codifica el ectodominio de MR, o de un fragmento que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.

48. Método in vitro de inhibición de la angiogénesis, que comprende la administración de un polinucleótido codificando el ectodominio de MR, o de un fragmento de éste que inhibe la angiogenesis, a tejido o células in vitro.