ANTICUERPOS DEL RECEPTOR 4 DE MUERTE (DR4) Y USOS DE LOS MISMOS.

Anticuerpos del receptor 4 de muerte (DR4) y usos de los mismos CAMPO DE LA INVECIÓN [0001] La presente invención se refiere en general a anticuerpos de DR4 y, en particular, a anticuerpos de DR4 monoclonales agonistas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Se cree que el control del número de células en mamíferos se determina, en parte, mediante un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, denominada a veces como muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular que resulta de algún trauma o lesión celular. Por el contrario, existe otra forma fisiológica de muerte celular que normalmente se desarrolla de forma ordenada o controlada. Esta forma de muerte celular ordenada o controlada se denomina a menudo como "apoptosis" [véase, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12: 487-493 (1994); Steller et al., Science, 267: 1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica se produce de forma natural en muchos procesos fisiológicos, incluyendo desarrollo embrionario y selección clonal en el sistema inmune [Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991)]. Los niveles reducidos de muerte celular apoptótica se han asociado con diversas afecciones patológicas, incluyendo cáncer, lupus e infección por virus herpes [Thompson, Science, 267: 1456-1462 (1995)]. Los niveles aumentados de muerte celular apoptótica pueden asociarse con otras afecciones patológicas, incluyendo SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentaria, degeneración cerebelar, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, lesión por reperfusión y enfermedad hepática inducida por toxinas [véase, Thompson, supra]. [0003] La muerte celular apoptótica habitualmente está acompañada por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en las células, tales como condensación del citoplasma, pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que diversas señales extrínsecas e intrínsecas desencadenan o inducen dichos cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, supra; Sachs et al., Blood, 82: 15 (1993)]. Por ejemplo, estos cambios pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la retirada de algunos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356: 314-317 (1992)]. Además, se ha descrito que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel, y E1A, y supresores tumorales, como p53, juegan un papel en la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, se ha observado que algunos fármacos de quimioterapia y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de apoptosis [Thompson, supra]. [0004] Diversas moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral- ("TNF-"), factor de necrosis tumoral-ß ("TNFß" o "linfotoxina-ß"), linfotoxina-ß ("LT-ß"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4- 1BB, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95) y ligando Apo-2 (también denominado TRAIL) han sido identificadas como miembros de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [Véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85: 3378-3404 (1995); WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3: 673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72: 847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357: 80-82 (1992)]. Entre estas moléculas, se ha descrito que TNF-, TNF-ß, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 y ligando Apo-2 (TRAIL) están implicadas en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que tanto TNF- como TNF-ß inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng et al. han descrito que TNF- está implicado en la apoptosis posterior a la estimulación de células T CD8 positivas [Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995)]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la eliminación de células T auto-reactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)]. [0005] Las mutaciones en los genes del receptor o ligando Fas/Apo-1 de ratón (llamados Ipr y gld, respectivamente) se han asociado con algunos trastornos autoinmunes, lo que indicaba que el ligando Apo-1 puede jugar un papel en la regulación de la eliminación clonal de linfocitos auto-reactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1449-1456 (1995)]. También se ha descrito que el ligando Apo-1 induce apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4 positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales agonistas de ratón que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad de destrucción celular que es comparable o similar a la del TNF- [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)]. [0006] Se cree que la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por dichas citoquinas de la familia de 2   TNF se inicia mediante su unión a receptores celulares específicos. Se han identificados dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado ADNc humano y de ratón que corresponden a ambos tipos de receptor [Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990); Schall et al., Cell, 61: 361 (1990); Smith et al., Science, 248: 1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026 (1991)]. Los polimorfismos extensivos se han asociado con ambos genes del receptor de TNF [véase, por ejemplo, Takao et al., Immunogenetics, 37: 199-203 (1993)]. Ambos TNFR comparten la estructura típica de los receptores de la superficie celular incluyendo regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores también se encuentran de forma natural como proteínas solubles de unión a TNF [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9: 3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8331 (1990)]. Más recientemente, la clonación de receptores de TNF solubles recombinantes fue descrita por Hale et al. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)]. [0007] La parte extracelular de TNFR de tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de cuatro dominios ricos en cisteína (CRD) denominados de 1 a 4, comenzando a partir del extremo NH2. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 restos de cisteína en posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRD son los siguientes: CRD1 - aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2 - aminoácidos de aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CRD4 - aminoácidos de aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CRD2 - aminoácidos de aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4 - aminoácidos de aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner et al., Cell, 73: 431-435 (1993)]. El papel potencial de los CRD en la unión a ligandos también ha sido descrito por Banner et al., supra. [0008] Existe un patrón repetitivo similar de CRD en otras proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature, 325: 593 (1987)], el antígeno de células B CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403 (1989)], el antígeno de células T OX40 [Mallet et al., EMBO J., 9: 1063 (1990)] y el antígeno Fas [Yonehara et al., supra y Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991)]. También se encuentran CRD en las proteínas T2 solubles similares a TNFR (sTNFP) de los virus de la viruela Shope y mixoma [Upton et al., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335 (1991); Upton et al., Virology, 184:... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal agonista aislado que (a) se une específicamente a un polipéptido receptor de muerte 4 (DR4) que comprende los residuos de aminoácidos 24-218, 1-218, ó 1-468 de la figura 1 (SEC ID NO:1), (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero que expresa el polipéptido DR4 y (c) no se une a los receptores señuelo DcR1 o DcR2, 2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano. 3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico. 4. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado. 5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha célula de mamífero es una célula cancerosa. 6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo que (1) el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo la American Type Culture Collection de Número de Acceso ATCC HB-12454 o (2) el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo la American Type Culture Collection de Número de Acceso ATCC HB-12455. 7. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 6. 8. Línea celular de hibridoma según la reivindicación 7, que ha sido depositada bajo la American Type Culture Collection de Números de Acceso ATCC HB-12454 o ATCC HB12455. 9. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, producido por la línea celular de hibridoma según la reivindicación 8. 10. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de DR4 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 11. Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador. 12. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho portador es un portador farmacéuticamente aceptable. 13. Método de inducción in vitro o ex vivo de la apoptosis en células de mamífero que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad eficaz de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 14. Método según la reivindicación 13, en el que dichas células de mamífero son células cancerosas. 15. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para inducir la apoptosis en células de mamífero. 16. Utilización según la reivindicación 15, en la que dichas células de mamífero son células cancerosas. 17. Artículo de fabricación, que comprende un recipiente y una composición contenida en dicho recipiente, en el que la composición incluye un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 18. Molécula dimérica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 unida a una inmunoglobulina heteróloga. 18   19     RECUENTO RECUENTO 21   % DE APOPTOSIS DE CÉLULAS 9D CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPO (µg/ml) 22   % DE APOPTOSIS DE CÉLULAS 9D % DE APOPTOSIS EN COMPARACIÓN CON Apo2L (1 µg) ANTICUERPO AUSENCIA DE Fc DE IgG ANTI-RATÓN DE CABRA PRESENCIA DE Fc DE IgG ANTI-RATÓN DE CABRA 23 NINGUNO   DO 450/620 DO 450/620 CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPO 4H6.17.8 (µg/ml) FIG 6 A CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPO 4E7.24.3 (µg/ml) FIG 6 B 24