ANTAGONISTAS SELECTIVOS DE huTNFR1.

La presente invención está relacionada con un ligando que se une específicamente al receptor del factor de necrosis tumoral hum ano de ti po 1 ( huTNFR1), el ligando c omprende u na o m ás sec uencias de ami noácidos d e or igen humano capaces de re ducir la respuesta inmunogénica del ligando en seres humanos y una o m ás secuencias de aminoácidos capaces de unirse de forma selectiva a huTNFR1. La presente invención está relacionada además con un ácid o nuc leico que codifica dicho ligando y a un a composición far macéutica para e l tratam iento d e trastor nos conectados con huTNFR1. El T NF es una citoq uina clave que regula la inflamación y la ap optosis. Dependiendo del tipo celular y el c ontexto ambiental, el TNF puede presentar efectos opuestos, la estimulación inmunitaria o la su presión inmunitaria, el T NF puede mediar la apoptosis así como la resistencia a la apoptosis (Locksley et al., Cell, 2001, Nº 104, p. 487-501; Aggarwal B. B., Nat. Rev. Immuno l., 2003, Nº 3, p 745-7 56). En huma nos, el TNF es una citoq uina esencial que regula la función del sistema inmunitario innato y las respuestas inflamatorias como un todo, aunque también se ha reconocido c omo u n me diador pat ogénico ce ntral de u na seri e de e nfermedades agudas y cró nicas. Específicamente, en artritis r eumatoide (A R), en e nfermedades i ntestinales infl amatorias com o l a enferme dad d e Crohn y colitis ulcerosa, en psoriasis y en unas cuantas enfermedades raras here ditarias como e l querubismo y el síndrome de fiebre periódica, asociadas con TNF y la sobreexpresión de TNFR1, respectivamente (Chatzantoni K, Mouzaki A., C urr. Top. Med. Chem., 2 006, Nº 6, p. 1707-1714; Ueki et al., Cell, 2007, Nº 1 28, p. 71-83; Simon A., Van der Meer J. W., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2007, Nº 292, p. R86-R98), el sistema TNF se ha identificado como el mediador patológicamente relevante. En las infecciones fulminantes virales o bacterianas que conducen al denominado síndrome d e la citoqui na, el TNF se cono ce por estar muy im plicado y está bi en documentado su p apel cruc ial com o me diador del ch oque s éptico y e l fall o mu ltiorgánico. El T NF tambié n está implicado en otras enfermedades, en particular enfermedades metabólicas que incluye la obesidad y la diabetes de tipo 2 (Hotamisligil G. S., Nature, 2006, Nº 444, p. 860-867; Storz et al., FEBS Lett., 1998, Nº 440, p 41-45) y algunas formas de he patitis (Kusters et al., Eur. J. Immunol., 19 97, Nº 27, p. 287 0-2875). Además, el TNF, a pesar de su actividad terapéutica conocida en el tratamiento local de ciertos cánceres, se co nsidera como promotor tumoral en otras enfermedades malignas, probablemente a través de la resistencia a la ap optosis mediada por NF-B y otras rutas d e su pervivencia ( Luo et al., Anti body engineering methods a nd protocols, 2 004, Hum an Pr ess, T owota, p. 135-159). Por l o tanto, los en sayos clínicos también exploran estrategias anti TNF como régimen terapéutico para ciertas neoplasias hematológicas (por ejemplo, AML). A partir de un punto de vista mecanicístico, se ha demostrado en numerosos modelos que incluye ratones knock-out para TNFR en los que el TNFR1 es el pr incipal mediador de los fenotipos patológicos de TNF (Locksley et al., Cell, 2001, Nº 104, p 487-501; Aggarwal et al., Nat. Rev. Immunol., 2003, Nº 3, p. 745-756). En vari as e nfermedades inf lamatorias cró nicas, l os r eactivos ne utralizadores d e T NF, específic amente los anticuerpos anti TNF y prot eínas de fusión de TNFR-Fc solubles, se aplican ampliamente de forma clínica. Están aprobados tre s fármacos que i nterfieren con la acción del T NF: Remic ade ( Vilcek y F eldmann, 2004) (Centocor/Tanabe), Enbrel (Immunex/Wyeth) y Humira (Celltech/Abbott). Todos los f ármacos tienen como diana el TNF en sí. Lo s fármacos están apro bados para el trata miento d e la artritis reumat oide (AR), AR juven il, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn y espondilitis anquilosante. Los fármacos que tienen como diana el TNF muestran un gran é xito frente a la A R, pero el efecto tera péutico dura s olamente un br eve periodo d e tiem po, y al gunos pacientes so n a prior i refrac tarios al trata miento de a nticuerpos anti T NF o desarr ollan resist encia. Además, l a aparición de ensayos clínicos con CDP571, un anticuerpo monoclonal humanizado específico de TNF, por ejemplo, en la enfermedad de Crohn, son ciertamente menos prometedores de lo esperado, pidiendo el desarrollo de nuevos conceptos y reactivos cuya diana sea el sistema TNF/TNFR. Además d e u na esperada supresión i nmune g eneral, los fárm acos anti T NF apr obados muest ran efectos secundarios adicionales como la producción de anticuerpos anti-dsiDNA, lupus y e nfermedad neuroinflamatoria. El estado inmunosuprimido de los pacientes bajo el bloqueo general de TNF está asociado con un aumento del riesgo de enfermedades infecciosas, incluyendo organismos comensales. En el "Estudio Lenercerpt" (1999), los ensayos clínicos de un age nte a nti-TNF para el tra tamiento de E M tuvo q ue c ancelarse de bido a qu e e l e stado d e la enfermedad empeoraba, en lugar de mejorar. El mecanismo de fondo, de esa respuesta adversa inesperada en ese momento, está ahora aclarado y está relacionado con el papel diferencial de TNFR1 y TNFR2 en esta enferme dad, con las señales de TNFR1 propagando la muerte neuronal y las señales de TNFR2 activando la regeneración de la capa d e mieli na. En conju nto, tal como se describe más ade lante existe un aum ento en las evi dencias sobre l as estrategias terapé uticas cu yo objetiv o es q ue la d iana se lectiva se a un receptor co n a cción T NF que en mucha s ocasiones ser á sup erior al bloqueo g eneral d e l a se ñalización de T NF. Por ejem plo, en algunos mode los de enfermedades anima les d etalladas más adelante, los ef ectos contra dictorios de l a acción de T NF se exp lican mediante una función diferencial de los distintos receptores, TNFR1 y TNFR2. El conocimiento adquirido sobre los mecanismos de acc ión d e T NF a nivel d e receptor ah ora sí abr e n uevas estrateg ias c on el objetivo de bloquear farmacológicamente uno de los receptores, resultando así en más efectos específicos potenciales. 2   Por ej emplo, l a isq uemia ret inal es u na c omplicación de la d iabetes cuando l as n euronas retin ales sufren una apoptosis i nducida por T NF que provoca ceguera. Las r etinas d e los r atones kn ockout para T NFR2 muestran un aumento de la ap optosis, p ero las r etinas de los r atones knocko ut pa ra T NFR1 muestran u n des censo de l a apoptosis en comparación con las de tipo salvaje (Fontaine et al., J. Neurosci., 2002, Nº 22, RC216). De forma sim ilar, EAE es un modelo animal de esc lerosis múltiple (EM). Se caracteriz a por u na inflamación inicial autoinmune dirigida contra la mielina. La reacción específica de mielina desaparece después pero aparecen otros epítopos como antígenos a utoinmunes. Mientras que los ratones kn ock-out p ara TNF muestran una re acción inflamatoria inicial más débil hacia la mielina, la r eacción inmune específica de mielina no desaparece. En raton es knock-out para TNFR1, la rea cción inflamatoria inicial está reducida igualmente, pero no desaparece, lo que indica que el TNFR2 es suficiente para mediar la función inmunosuprosora a largo plazo de TNF, mientras que la reacción inflamatoria está mediada por TNFR1 (Kassiotis G., Kollias G., J. Exp. Med., 2001, Nº 193, p. 427-434; Kollias et al., Curr. Dir. Autoimmun., 2002, Nº 5, p. 30 to 50; Owens et al., Nat. Med., 2001, Nº 7, p. 161-166). De form a sim ilar, e n un m odelo d e r atón de to xina (c uprizona) i ndujo, d esmielinización rev ersible d el SNC, pareciéndose a las fases de desmielinización/ regeneración de la escl erosis múltiple (EM), habie ndo evidencias de que el proceso de remi elinización tras l a r etirada d e l a toxin a d epende de T NF y r equiere d e forma selectiv a l a señalización d e T NFR2, dis parando la e xpansión de l progenitor de oli godendrocitos y la diferenciación d e oligodendrocitos en lám inas de m ielina ma duras (Arnett et al., N at. Ne urosci., 2 001, Nº 4, p. 11 16-1122). Esto s hallazgos de l a dependencia de T NF en la dege neración de ol igodendrocitos refleja la situación de humanos que padecen EM: En ens ayos clínicos cuyo objetivo es un bloqueo completo de TNF en EM con u na proteína de fusión de T NFR1-Fc, el bl oqueo d e T NF se asoció co n un agravamiento d e la e nfermedad en l ugar de un b eneficio terapéutico, lo cual está de acuerdo con los resultados del modelo animal descrito anteriormente. Además, por ejem plo las ne uronas corticales de los ratones suc umben a la muerte e xcitotóxica tras la ev idente activación d el receptor NM DA medi ante el ne urotransmisor gl utamato. El glutam ato se lib era d esde el tej... [Seguir leyendo]

1. Un li gando de l h uTNFR1 qu e com prende una co nstrucción d e proteínas c on ( i) una o m ás s ecuencias de aminoácidos de origen humano capaces de reducir la respuesta inmunogénica de dicho ligando del huTNFR1 en humanos, y (ii) una o más secuencias de aminoácidos de origen no humano capaces de unirse de forma selectiva al huTNFR1, en la que la construcción de proteínas comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7 como domin io variable de la cadena pesada (VH) y la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 8 com o dominio variable de la cadena ligera (VL), o un fragme nto de u n anticuerpo humanizado, siendo el fragmento una scFv que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 9. 2. El lig ando de huT NFR1 de acu erdo con reivindicación 1, qu e comprende un a cola adicional que permite la interacción específica con un compuesto aceptable a nivel biológico. 3. El ligando de huTNFR1 de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la construcción de proteínas además comprende un compuesto aceptable a nivel biológico unido de forma no covalente o unido de forma covalente a ésta mediante la conjugación química post-traduccional o mediante tecnología de DNA recombinante. 4. El ligando de huTNFR1 de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el compuesto aceptable a nivel biológico se selecciona de entre el grupo que consiste en las proteínas séricas. 5. El liga ndo d e huT NFR1 de acuer do co n las reivin dicaciones 3 o 4, en las q ue el compuesto ac eptable a niv el biológico es la albúmina. 6. El ligando de huTNFR1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 5, en las que la construcción de proteínas comprende una proteína de fusión con albúmina sérica humana de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 10. 7. Un ácido nucleico que codifica el ligando del huTNFR1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6. 8. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7. 9. Una c élula huésped ais lada q ue c ontiene e l áci do nucleico de acuerdo co n la r eivindicación 7 o el vector de acuerdo con la reivindicación 8. 10. U na c omposición farm acéutica q ue comprende u na ca ntidad efectiva a n ivel terap éutico d el l igando del huTNFR1 de acuer do co n cual quiera d e l as reivi ndicaciones d e 1 a 6 , y o pcionalmente uno o más compon entes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste en un transportador aceptable a nivel farmacéutico, sales aceptables a nivel farmacé utico, un a gente au xiliar, un estabilizante, un d iluyente y u n so lvente, o cua lquier combinación de los mismos. 11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para el tratamiento de la artritis reumatoide, psoriasis, enf ermedad de Cr ohn, co litis ulcerosa y otras enferme dades inflamatorias crónic as y /o autoinmunes, infecciones virales o b acterianas agudas fu lminantes, e nfermedades m etabólicas, enfermedades neurodegenerativas agudas, enfermedades neurodegenerativas crónicas, preferiblemente seleccionadas de entre la esclerosis m últiple, enf ermedad de Parki nson y Alzheimer, enferme dades g enéticas hereditarias e n las que T NF/ TNFR1 es el medi ador patológico ca usante, preferi blemente se leccionadas de e ntre el síndrom e de la fi ebre periódica y el querubismo, y el cáncer. 12. Un proceso para la producción de un ligando de huTNFR1 con una respuesta inmunogénica reducida cuando se administra a u n ser hum ano, que com prende los pasos de (a) proporcionar una construcción de pr oteína como la que se ha d efinido en cu alquiera d e las reivin dicaciones de 1 a 6, (b) identific ar una o más secuencias de aminoácidos d e orige n hum ano ca paces de un irse de fo rma selectiv a al huT NFR1 mediante sel ección g uiada utilizando una o más de las secuencias de aminoácidos de la construcción de proteína como matriz, y (c) construir el ligando que comprende al menos una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en el paso (b). 13. L a uti lización de un li gando de l h uTNFR1 qu e c omprende una c onstrucción de proteín a d e acuerdo c on cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, como matriz para la selección guiada en la identificación y construcción de otro li gando de huT NFR1 de baj a inmunogenicidad que comprende sólo secu encias de ami noácidos de origen humano. 23   24     26   digestión Digestión por PCR digestión 27 digestión Líder peIB Sitio de unión a ribosoma Promotor lacZ   28   Fig.6 Unión específica Libre Unido/libre 29 Representación Scatchard Unido   Figuras 7A a 7F   Viabilidad [% de control] % de protección 16h de tratamiento con Kym I 16h de tratamiento con Kym I 31   albúmina 32