Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a la CD40 humana,

comprendiendo un dominio variable de cadena pesada humanizado y un dominio variable de cadena ligera humanizado, en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente

Anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos para utilizarlos.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional US 60/684,853, presentada el 26 de mayo de 2005.

Antecedentes

Esta invención se refiere generalmente a anticuerpos anti-CD40 humanizados para el uso terapéutico y diagnóstico. Más concretamente, se describen anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos de uso para el tratamiento de diversas enfermedades c trastornos caracterizados por células que expresan la CD40. También se describen composiciones farmacéuticas y productos manufacturados, tales como kits comprendiendo el anticuerpo anti-CD40 humanizado.

La CD40 es una glicoproteína de membrana integral tipo I y un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). La CD40 se expresa en una variedad de tipos de células incluyendo las células B neoplásicas y normales, células interdigitantes, células epiteliales basales y carcinomas. También está presente en monocitos, macrófagos, algunas células endoteliales y células dendríticas foliculares. La CD40 se expresa en la ontogenia temprana de células B, que aparece en precursores de células B después de la aparición de la CD10 y la CD19, pero antes de la expresión de la CD21, la CD23, la CD24, y la aparición de la inmunoglobulina superficial M (sIgM) (Uckun et al., 1990, Blood 15: 2449). Aunque los primeros informes indicaban que la CD40 se perdía en la diferenciación terminal de las células B en las células plasmáticas, se ha detectado CD40 en células plasmáticas derivadas de la médula ósea y de las amígdalas (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84: 2597).

La interacción de la CD40 con su ligando y contrarreceptor, CD40L (también conocida como CD154, gp39, y TRAP), induce ambas respuestas inmunes, la celular y la humoral. La CD40L es una proteína transmembrana expresada predominantemente en linfocitos o células T CD4⁺ activadas. Al igual que otras proteínas de la familia del TNF, la estructura de la CD40L es la de un trímero no covalente. La señalización mediada por la CD40 parece ser necesaria para la proliferación de células B, el cambio del isotipo (Ig) de la inmunoglobulina, la formulación del centro germinal, y el cometido de las células B de memoria en respuesta al antígeno dependiente de las células T. La unión de la CD40L a la CD40 produce una multimerización de la CD40, la generación de señales de activación para las células que presentan el antígeno como las células dendríticas, monocitos y linfocitos B, y la generación de señales de crecimiento y diferenciación de fibroblastos y células epiteliales activados por citoquinas. Si bien las vías de señalización a través de las cuales las moléculas de la CD40 funcionan en la diferenciación celular no han sido completamente aclaradas, las señales de la CD40 son transducidas del receptor multimerizado a través de la incorporación de una serie de factores asociados al receptor de TNF ("TRAF") (Kehry, 1996, J. Immumol. 156: 2345-2348). Los subconjuntos de TRAF interactúan diferencialmente con miembros de la familia del receptor del TNF, incluyendo la CD40, proporcionando estímulos para una amplia variedad de vías aguas abajo. El TRAF2 y el TRAF1 están implicados en la modulación de la apoptosis (Speiser et al., 1997, J. Exp. Med. 185: 1777-1783; Yeh et al., 1997, Immunity 7: 715-725). Los TRAF 2, 5 y 6 participan en la activación y proliferación de eventos. En las células B normales, la unión de la CD40 con la CD40L incorpora el TRAF2 y el TRAF3 al complejo del receptor e induce la regulación a la baja de los TRAF (Kuhne et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 337-342).

La apoptosis y la señalización mediada por la CD40 están estrechamente vinculadas durante el desarrollo y la diferenciación de las células B. Una función principal de la apoptosis en las células B es la deleción clonal de las células B inmaduras, que se cree que es el resultado de extensos entrecruza miento de la Ig de superficie en células B inmaduras. El destino de las células B maduras también es modulado por una combinación de señalización a través de la Ig de superficie y las señales derivadas forman células T activadas, probablemente mediadas por las moléculas de la CD40L. Una combinación de las señales de la Ig de superficie y la CD40 puede reemplazar la vía apoptótica y mantener la supervivencia de las células B del centro germinal. Este rescate de la apoptosis en los centros germinales es fundamental para el desarrollo de las células B de memoria productoras de anticuerpos de afinidad.

En los tumores malignos de células T y B, a menudo se producen efectos antitumorales (detención del crecimiento con o sin apoptosis) cuando las células malignas son expuestas a estímulos que conducen a la activación de los linfocitos normales. Se ha observado esta detención del crecimiento inducido por la activación con señales a través de o bien receptores de antígenos o receptores coestimuladores (Ashwell et al., 1987, Science 237: 61; Bridges et al., 1987, J. Immumol. 139: 4242; Page y Defranco, 1988 J. Immunol. 140: 3717; y Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 501). La estimulación de la CD40 por cualquiera de entre el anticuerpo anti-CD40 o la CD40L soluble inhibe directamente el crecimiento de linfomas de células B (Funakoshi et al., 1994, Blood 83: 2787-2784).

Se han descrito varios anticuerpos monoclonales murinos (mAb) dirigidos contra la CD40 (Katira et al. 1995, "CD40 Workshop Panel Report"; en: Leukocyte Typing V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1: 547-550). Por ejemplo, se demostró que dos mAb, el CD40.7 (M2) y el CD40.8 (M3), inhiben la unión de la CD40 a la CD40L (Fanslow et al. 1995, en: Leukocyte Typing V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1: 555-556). La estimulación de la CD40 por los mAb M2 y M3 inhibió el crecimiento de varios linfomas de células B humanos y la regresión de tumores inducidos establecidos in vivo (Funakoshi et al., 1994, Blood 83: 2787-2794; Funakoshi et al., 1996, J. Immunol. 19: 93-101). La patente US 5,182,368 divulga un mAb murino anti-CD40, el G28-5, que puede aumentar la proliferación de células B. Una inmunotoxina monocatenaria basó la región Fv monocatenaria de líneas celulares malignas hematológicas que expresaban la CD40 humana selectivamente asesinadas in vitro por el G28-5 (Francisco et al., 1997, J Biol. Chem. 39: 24165-24169). Sin embargo, el G28-5 no mejora la activación de las células B en presencia de la CD40L y no potencia la unión de la CD40 y la CD40L. La patente US 6,838,261 (y patentes relacionadas US 6,946,129 y 6,843,989) describe una clase de variantes del mAb murino anti-CD40, el S2C6, y su uso en el tratamiento de diversos trastornos, incluyendo el cáncer y enfermedades inmunológicas e inflamatorias. Además de mejorar la estimulación mediada por la CD40L, un anticuerpo anti-CD40 descrito en la patente US 6,838,261 mostró la mejora de la interacción entre la CD40 y la CD40L, y la actividad antineoplásica in vivo. Aunque el S2C6 por sí mismo estimula la proliferación de células B de una manera similar al G28-5, el S2C6 se distingue del G28-5 por su capacidad de aumentar ``la unión a la CD40L y la magnitud posterior de la señal de activación mediada por la CD40L.

Otros mAb murinos anti-CD40, por ejemplo, descritos en la publicación internacional Número WO 95/17202, une la CD40 y muestra eficacia en el tratamiento y prevención de enfermedades caracterizadas por células neoplásicas que expresan la CD40. Aunque los anticuerpos anti-CD40 de ratón tienen una aplicación potencial como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la CD40 en humanos, su inmunogenicidad presenta la posibilidad de una respuesta a los anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (HEMA) que limitaría su valor.

Tai, Yu-Tzu et al (Cancer Research, 2004, 64, 2846-2852) describe que un anticuerpo anti-CD40 humanizado, denominado en el documento "SGN-40", induce citotoxicidad en células de mieloma múltiple humanas. Se afirma en la página 2846, Col 2, que el "SGN-40" representa un anticuerpo anti-CD40 humanizado diseñado a partir del mAb de ratón SGN-14. No se proporciona ninguna información sobre la secuencia o estructura del anticuerpo "SGN-40" que se utilizó.

Por lo tanto, hay una demanda de anticuerpos anti-CD40 humanizados que se unan específicamente a epítopos definidos de la CD40 y que muestren la especificidad, afinidad y otras...

1. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a la CD40 humana, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada humanizado y un dominio variable de cadena ligera humanizado, en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

2. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 1, comprendiendo además una región constante de IgG humana.

3. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 2, en el que el isótopo de la región constante de IgG es IgG₁, IgG₂, IgG₃ ó IgG₄.

4. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 3, en el que el isótopo de la región constante de IgG es IgG₁.

5. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo además un dominio constante de cadena ligera.

6. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 5, en el que el dominio constante de cadena ligera es un dominio constante kappa.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende además una región constante de inmunoglobulina humana.

8. Anticuerpo según la reivindicación 7, comprendiendo las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera indicadas en la SEC ID Nº: 19 y SEQ ID Nº: 22, respectivamente.

9. Fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 1, en el que el fragmento del anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, un diacuerpo, un anticuerpo monocatenario o un fragmento scFv.

10. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo además una etiqueta detectable.

11. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que está aislado.

12. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno compite por la unión con el anticuerpo monoclonal S2C6 que es secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro ATCC PTA-110.

13. Kit comprendiendo, en un recipiente, el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y, opcionalmente, instrucciones para utilizar los anticuerpos para detectar la proteína CD40 en una muestra biológica.

14. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para utilizar como un medicamento.

15. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 14, en el que el medicamento es para tratar un trastorno inmunológico o un cáncer que exprese la CD40, caracterizado por la expresión de la CD40.

16. Composición farmacéutica comprendiendo: