Un anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro Biotecnologie Avanzate,

Génova, caracterizado porque es un anticuerpo específico para al menos una secuencia peptídica de una proteína BAG-3 humana seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18

Campo de la invención

La presente invención proporciona secuencias del nucleótido y la proteína BAG3 para su uso en investigación, diagnosis y terapia de enfermedades relacionadas con la muerte celular, y para la modulación de la supervivencia y/o muerte celular.

Más particularmente la invención se refiere al uso de construcciones basadas en oligonucleótidos no codificantes específicos y anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de péptidos en leucemias, otras neoplasias y enfermedades relacionadas con la muerte celular.

Antecedentes

La muerte celular por apoptosis es el responsable principal del control de los procesos de homeostasis, de diferenciación e inmunitarios en tejidos. Las alteraciones en el programa de apoptosis están involucradas en daños crónicos y agudos de tejidos (isquemia cardiaca, renal, cerebral o de otros tejidos, trastornos degenerativos crónicos tales como la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y otras, etc.), caracterizadas por una apoptosis excesiva, y enfermedades neoplásicas, autoinmunitarias y de otro tipo que suponen una apoptosis insuficiente. Además, puesto que los compuestos anti-neoplásicos actúan principalmente induciendo la apoptosis en células cancerígenas, las moléculas involucradas en la respuesta apoptótica determinan la sensibilidad o resistencia de la célula neoplásica al tratamiento. Los componentes y/o reguladores bioquímicos de las vías apoptóticas pueden ser dianas para tratamientos de modulación, algunos de los cuales se han mostrado eficaces en modelos preclínicos y ahora se encuentran en ensayos clínicos en humanos. Además, las moléculas involucradas en la apoptosis pueden representar herramientas diagnósticas en un grupo de enfermedades y reactivos para el trabajo de laboratorio (1).

BAG3 es un miembro de la familia de proteínas BAG, involucrada en la actividad co-chaperona para el plegamiento intracelular de proteínas (2). Aunque BAG3 presenta homología con los otros miembros de la familia BAG en algunas partes, como el dominio BAG, otras partes de sus secuencias de nucleótidos y proteínas son únicas (2-4). Hemos utilizado estas porciones únicas, específicas de BAG3, para la invención descrita en el presente documento.

A continuación se presentan las secuencias de nucleótidos y péptidos de BAG3; las partes subrayadas corresponden a partes que se consideran particularmente relevantes para la presente invención.

Secuencia de nucleótidos de BAG3 (SEQ ID NO: 1): Referencia: NCBI PubMed, XM 055575 atanogen 3 asociado a BCL2 de Homo sapiens (BAG3), ARNm gi|16156810|ref|XM — 055575.1|[16156810]

**(Ver fórmula)**

Secuencia de aminoácidos de BAG3 (SEQ ID NO: 2): Referencia: NCBI PubMed, XM 055575 atanogen 3 asociado a BCL2 de Homo sapiens (BAG3), ARNm gi|16156810|ref|XM - 055575.1|[16156810]

**(Ver fórmula)**

Se sabe que la proteína BAG3 se expresa en algunas líneas celulares, tal como HeLa y A2058, y en cuanto a lo que se refiere a células humanas primarias normales, en células de músculo esquelético, cardiacas, de ovario y otros tipos de células normales (2-5). La expresión de BAG3 también se ha detectado en células tumorales de páncreas humano (6).

No se ha informado de la expresión de BAG3 en otros tipos de células primarias normales o neoplásicas antes de los resultados presentados por primera vez en el presente documento.

Algunos hallazgos describen que la transfección de células de la línea celular humana HeLa (5) o de la línea celular murina 32D (7) con construcciones que hiperexpresan BAG3 pueden incrementar modestamente la apoptosis celular inducida por microinyección de Bax o a través de Fas (5), o por privación de IL-3 (7), respectivamente.

En los documentos WO 00/14106 y WO 95/25125 se han descrito anticuerpos genéricos para BAG3, y sin embargo no se ha caracterizado ningún sitio inmunógeno específico para ellos. Las referencias 4-6 describen anticuerpos policlonales específicos para la región carboxi-terminal de la proteína BAG3 que comienza específicamente en el aminoácido 306. Liao describe un anticuerpo policlonal de conejo anti-BAG3 dirigido contra los 196 aminoácidos de la porción C-terminal de BAG3. Lee describe un anticuerpo policlonal contra la región de aminoácidos que abarca la porción 306-575. Dong describe un anticuerpo policlonal contra las dos regiones de aminoácidos 2 y 8.

El resumen de patente de la publicación japonesa 10327872 describe usos de BAG3 para el diagnóstico, la profilaxis y el tratamiento de patologías relacionadas con la apoptosis, pero sin embargo no se ha caracterizado ningún sitio inmunógeno o ningún anticuerpo específico, y además no se han realizado pruebas, en particular en humanos.

Antes de los resultados presentados por primera vez en el presente documento, no se había probado que la expresión de BAG3 influyese en la apoptosis de células primarias humanas, ya sean normales, neoplásicas o afectadas por otros tipos de patologías. Además, nunca se había informado de la modulación en defecto de BAG3 por reactivos tales como oligonucleótidos, que se pueden usar en células primarias, y sus efectos sobre la apoptosis celular.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a la proteína BAG3 (SEQ ID NO: 2) y a la secuencia de nucleótidos correspondiente (SEQ ID NO: 1) y a partes de ellas (indicadas por el subrayado dentro de las secuencias largas anteriormente mencionadas).

Una primera forma de realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro Biotecnologie Avanzate, Génova, caracterizado porque es un anticuerpo específico para al menos una secuencia peptídica de una proteína BAG-3 humana seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un clon madre de hibridoma nº PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro Biotecnologie Avanzate de Génova para la producción del anticuerpo según la reivindicación 1.

El objeto de la presente invención se ha conseguido mediante un procedimiento de preparación del anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009, con una construcción de Péptidos antigénicos múltiples (MAP) que comprende los siguientes péptidos BAG-3:

MAP-BAG3-1: NH2-DRDPLPPGWEIKIDPQ-MAP que contiene la SEQ ID NO 15 MAP-BAG3-2: NH2-SSPKSVATEERAAPS-MAP que contiene la SEQ ID NO 16 MAP-BAG3-3: NH2-DKGKKNAGNAEDPHT-MAP que contiene la SEQ ID NO 17 MAP-BAG3-4: NH2-NPSSMTDTPGNPAAP-MAP que contiene la SEQ ID NO 18.

Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende el anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009.

Una forma de realización más de la presente invención se refiere a un agente diagnóstico que comprende el anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009, para la detección de la expresión de BAG-3 en células primarias.

Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere a un kit para la identificación de la expresión de BAG-3 en células primarias que comprende el anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009.

Los reactivos y composiciones para los usos descritos en la presente invención incluyen adicionalmente vectores, incluyendo vectores de expresión, virus, etc., que contienen secuencias específicas de BAG3; células manipuladas genéticamente para contener dichas secuencias y células manipuladas genéticamente para expresar dichas secuencias. Los reactivos incluyen adicionalmente el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente.

Las composiciones para los usos descritos en la presente invención además pueden comprender un vehículo aceptable, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones diagnósticas, pronosticas y terapéuticas para el uso relacionado con BAG3 relacionadas con la presente invención también son valiosas actualmente para aplicaciones veterinarias. Los receptores deseados para dichas aplicaciones son particularmente animales domésticos y caballos de pura raza, además de seres humanos.

Los usos basados en BAG3 descritos en la presente invención también se refieren a reactivos y/o procedimientos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo AC-1 secretado por el clon madre de hibridoma nº PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro

Biotecnologie Avanzate, Génova, caracterizado porque es un anticuerpo específico para al menos una secuencia 5 peptídica de una proteína BAG-3 humana seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18.

2. Un clon madre de hibridoma nº PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro Biotecnologie Avanzate de Génova para la producción del anticuerpo según la reivindicación 1.

3. Un procedimiento para la preparación del anticuerpo de la reivindicación 1 usando una construcción de Péptidos antigénicos múltiples (MAP) que comprende los siguientes péptidos BAG-3:

- MAP-BAG3-1: NH2-DRDPLPPGWEIKIDPQ-MAP que contiene la SEQ ID NO 15

- MAP-BAG3-2: NH2-SSPKSVATEERAAPS-MAP que contiene la SEQ ID NO 16

- MAP-BAG3-3: NH2-DKGKKNAGNAEDPHT-MAP que contiene la SEQ ID NO 17 15 - MAP-BAG3-4: NH2-NPSSMTDTPGNPAAP-MAP que contiene la SEQ ID NO 18.

4. Composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1.

5. Un agente diagnóstico que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 para la detección de la expresión de 20 BAG-3 en células primarias.

6. Kit para la detección de la expresión de BAG-3 en células primarias que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1.