Péptido caracterizado porque se une in vitro, de manera específica,

a una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades y porque se elige de una de las siguientes secuencias:

a)la secuencia RELGSMLESPMEFLFDTI DDVTAS (SEQ ID NO: 1), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;

b)la secuencia LGSMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 2), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;

c)la secuencia GSMLESPMEFLFDTI DDVTAS, procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro;

d)la secuencia SMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 3), procedente de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro; y

e)la secuencia VKKKKIKREIKISMLESPMEFLFDTIDDVTAS (SEQ ID NO: 6), procedente de la proteína Cka2 de Theileria parva y de la proteína E4orf4 de adenovirus de tipo 2 de perro

Péptidos que se unen a la proteína fosfatasa 2A y polinucleótidos que codifican para los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos que se unen a la proteína fosfatasa 2A, una diana importante para el control de la apoptosis, concretamente en las células cancerosas, así como para el control de infecciones virales y parasitarias.

Descripción de la técnica anterior

Dado el papel de los péptidos de la invención en la modulación de la actividad de la proteína fosfatasa 2A celular, es importante recordar el estado de conocimiento actual sobre las proteína fosfatasas 2A, su papel fisiológico y sus interacciones con ciertas proteínas celulares, virales o parasitarias.

La fisiología de la célula está controlada en parte por la modulación del estado de fosforilación de las proteínas. El estado de fosforilación de las proteínas celulares depende de la acción antagonista de las proteína cinasas que las fosforilan y de las proteína fosfatasas que las desfosforilan.

Las proteína fosfatasas se dividen en dos grupos principales: las tirosina fosfatasas y las serina/treonina fosfatasas. Las serina/treonina fosfatasas se clasifican en dos categorías según la especificidad de su sustrato y su sensibilidad a ciertos inhibidores, las fosfatasas de tipo 1 (PP1) y las fosfatasas de tipo 2 (PP2). Las fosfatasas de tipo 2 se dividen todavía en diferentes clases, incluyendo la fosfatasa 2A (PP2A), la fosfatasa 2B (PP2B) o la calcineurina cuya actividad está regulada por calcio, y la fosfatasa 2C (PP2C) cuya actividad depende de magnesio.

In vivo, las serina/treonina proteína fosfatasas PP1 y PP2A forman dos familias de varias holoenzimas de expresión ubicua que se producen mediante la interacción específica entre sus subunidades catalíticas (PP1 c y PP2Ac) y una gran variedad de subunidades reguladoras, y que están implicadas en la selección como diana y/o la regulación de la actividad fosfatasa (para una revisión reciente, véase Garcia A. et al., PP1 et PP2A des ser/thr phosphatases au coeur de l'apoptose (2001) Med/Sci 17, 1214-1216).

Ahora se sabe que las fosfatasas de tipo 2A están muy conservadas en el transcurso de la evolución y se activan potencialmente en la regulación de numerosos procesos biológicos. Las enzimas PP2A están implicadas claramente en la regulación de la transcripción, el control del ciclo celular y la transformación viral. Además, las PP2A son la diana de diferentes proteínas virales o parasitarias, lo que sugiere un papel de las PP2A en las interacciones huéspedes-patógenos.

Las PP2A son complejos oligoméricos (holoenzimas) que comprenden cada uno una subunidad catalítica C y una o dos subunidades reguladoras, (A) y (B). La estructura de la subunidad (A) consiste en 15 repeticiones imperfectas de una secuencia de aminoácidos conservada de 38 a 40 aminoácidos, interaccionando algunos de los cuales con las subunidades (B) y (C). Las subunidades (A) y (C), conservadas en el transcurso de la evolución, forman la estructura de base de la enzima y se expresan de manera constitutiva. Por el contrario, las subunidades (B) constituyen una familia de proteínas reguladoras sin estructura común y expresadas de manera diferencial (Cohen P. The structure and regulation of protein phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 1989; 58: 453-508). Así, las proteína fosfatasas 2A existen in vivo en dos formas diferentes: una forma dimérica (AC) y una forma trimérica (ABC). Las subunidades (B) regulan la actividad fosfatasa y la especificidad con respecto al sustrato. La existencia de formas múltiples de PP2A está correlacionada con distintas y variadas funciones de las PP2A in vivo.

Recientemente, diferentes proteínas no celulares, y en particular proteínas virales y parasitarias, se han implicado en la modulación de ciertas actividades específicas de las proteína fosfatasas 2A.

Los virus han adoptado diferentes estrategias que implican a PP2A con el fin de facilitar su replicación y su supervivencia en la célula del huésped. Por ejemplo, el virus parainfluenza incorpora en su partícula viral la proteína PKC ?, proteína de origen celular bajo el control de la PP2A. Esto le permite perturbar la fosforilación de las proteínas de su huésped y facilitar su propia replicación (B.P. Gupta et al. Cellular protein kinase C ? regulates human parainfluenza virus type 3 replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92: 5204-8).

Varios virus de ADN que tienen un poder transformante, tales como los Papovaviridae o los adenovirus, igual que ciertos retrovirus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), codifican para proteínas que interaccionan directamente con ciertas PP2A del huésped. Todos estos virus comprenden proteínas que aunque son estructuralmente diferentes, interaccionan con ciertas holoenzimas y modifican así la actividad fosfatasa.

Se ha demostrado en particular que la proteína E4orf4 de los adenovirus se une a una PP2A heterotrimérica, y con más precisión, a una subunidad reguladora (B), lo que conlleva una disminución de la transcripción de JunB en la célula infectada. Este efecto podría desempeñar un papel importante durante la infección viral regulando la respuesta apoptótica de las células infectadas. De manera interesante, también se ha demostrado que la interacción de E4orf4 con la PP2A induce la apoptosis de células transformadas de manera independiente de p53 (Shtrichman R. et al. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 1998; 72: 2975-82).

Los virus oncógenos de ADN de la familia de los Papovaridae, incluyendo SV40 y el virus del polioma, inducen la transformación celular. Se ha demostrado que la PP2A interacciona con los antígenos "T pequeño" de SV40 y "T pequeño" y "T medio" del virus del polioma. Estas interacciones de proteínas virales con la PP2A se han implicado claramente en la transformación viral. Finalmente, la regulación transcripcional, un proceso realizado normalmente en la célula por los diferentes factores que se fijan específicamente a secuencias reguladoras promotoras, representa probablemente el mecanismo más importante implicado en el control de la expresión viral por la PP2A. Así, se ha demostrado que la PP2A es un regulador negativo de numerosos factores de transcripción implicados concretamente en los procesos de crecimiento y de proliferación celular, incluyendo AP1/SRE, NF-kB, Sp1 y CREB (Waszinski, B.E. et al. Nuclear protein phosphatase 2A dephosphorylates protein kinase A-phosphorylated CREB and regulates CREB Transcriptional stimulation. Mol. Cell Biol. 1993: 13,2822-34). La regulación viral de estos factores de transcripción permitiría modular la transcripción viral.

La proteína viral de VIH-1, Vpr, interacciona in vitro con la PP2A y estimula así la actividad catalítica (Tung L, et al., Direct activation of protein phosphatase 2A0 by HIV-1 encoded protein complex Ncp7:vpr. FEBS Lett 1997; 401: 1997-201). Vpr puede inducir la detención en G2 de células infectadas inhibiendo la activación del complejo p34cdc2-ciclina B. Por otra parte, Vpr interacciona con el factor de transcripción Sp1 y es un trans-activador débil de la transcripción de VIH-1 dependiente de Sp1. Así, la proteína Vpr de VIH-1, que está incorporada en el virión, estaría implicada in vivo en la iniciación de la transcripción viral, una etapa evidentemente esencial para regular la expresión del factor de transcripción Tat (un regulador principal de la transcripción codificado por el virus VIH-1).

A diferencia del papel bien establecido de las proteína cinasas en las infecciones parasitarias, ha sido únicamente en el transcurso de los últimos años cuando ha empezado a reconocerse que las serina/treonina fosfatasas son reguladores potenciales importantes en el campo de la parasitología.

La ausencia de motivos comunes para el conjunto de las proteínas que interaccionan con PP2A impide la identificación bioinformática sencilla de los motivos peptídicos directamente implicados en la unión de estas proteínas con PP2A.

Ahora bien, dado el papel principal de las proteína fosfatasas 2A en las interacciones virus-huéspedes o parásitos-huéspedes tal como se resumió anteriormente, se comprende el interés de identificar los sitios de unión de las proteínas virales o parasitarias con las holoenzimas PP2A o una de sus subunidades, con el fin de identificar dianas terapéuticas novedosas para estos patógenos, virales o...

1. Péptido caracterizado porque se une in vitro, de manera específica, a una holoenzima proteína fosfatasa de tipo 2A o una de sus subunidades y porque se elige de una de las siguientes secuencias:

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque está acoplado a un vector que puede transferir dicho péptido a una célula eucariota.

3. Polipéptido caracterizado porque está constituido por la repetición de un péptido según la reivindicación 1 ó 2.

4. Polinucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia codificante de un péptido según la reivindicación 1 ó 2.

5. Polinucleótido caracterizado porque consiste en un multímero del polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Vector de expresión celular, caracterizado porque comprende un polinucleótido según la reivindicación 4 ó 5 y secuencias reguladoras que permiten la expresión de un péptido según la reivindicación 1 ó 2 en una célula huésped.

7. Anticuerpo purificado policlonal o monoclonal caracterizado porque puede unirse de forma específica a uno cualquiera de los péptidos según la reivindicación 1 ó 2.

8. Composición farmacéutica que comprende uno de los péptidos según la reivindicación 1 ó 2, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Composición farmacéutica que comprende un elemento elegido de un polinucleótido según la reivindicación 4 ó 5, un vector de expresión según la reivindicación 6 o un anticuerpo según la reivindicación 7.

10. Uso de los péptidos definidos según la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de tumores.

11. Uso de un péptido definido según la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento adecuado para inducir la apoptosis de células diana, y en particular de células tumorales.

12. Uso de un péptido definido según la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento del cáncer.

13. Uso de un polinucleótido según la reivindicación 4 ó 5 o de un anticuerpo según la reivindicación 7, en el diagnóstico in vitro del cáncer.