METODO PARA LA IDENTIFICACION DE COMPUESTOS QUE INDUCEN O INHIBEN ESTRES DE RETICULO ENDOPLASMATICO O ESTRES OXIDATIVO.

Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplasmático o estrés oxidativo.

La presente invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos productores o inhibidores de estrés de retículo endoplasmático o de estrés oxidativo. Dicho método se basa en la transformación de células de manera estable con un vector que exprese un gen reportero bajo el control del gen DDIT3 (también denominado CHOP). Este promotor comprende los nucleótidos del -1626 al +60 de dicho gen, habiendo dos variantes del mismo: -1507 C/G. Mientras que la variante-1507 C no se activa en condiciones de estrés oxidativo, la -1507 G responde a este estímulo de manera acusada. Por otro lado, ambos promotores se activan en situación de estrés de retículo endoplasmático, o en situación combinada de ambas condiciones

Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplasmático o estrés oxidativo.

La presente invención se relaciona, en general, con un método para la identificación de compuestos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Dicho método se basa en un modelo celular de neurodegeneración útil para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades neurodegenerativas son procesos crónicos y progresivos que están caracterizados por pérdidas selectivas y simétricas de neuronas en los sistemas motor, sensorial y cognitivo. Estas enfermedades están creciendo alarmantemente en los países desarrollados debido a diversos factores, entre ellos, el paulatino envejecimiento de la población y los cambios en el estilo de vida. No existe todavía ningún tratamiento adecuado para dichas enfermedades.

Estrés Oxidativo (EO)

Las especies reactivas de oxígeno (ROS, "reactive oxygen species"), tales como el radical de oxígeno superóxido (O^2-) o peróxido de hidrógeno (H₂O₂), se producen durante los procesos metabólicos normales y realizan varias funciones útiles. Las células están dotadas con varios mecanismos para controlar los niveles de estos agentes oxidativos, por ejemplo, superóxido dismutasa (SOD), glutatión o vitamina E. En condiciones fisiológicas normales, existe un equilibrio entre ROS y estos mecanismos antioxidativos. Una producción excesiva de ROS y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidativas pueden conducir a estrés oxidativo celular y por tanto, a estados patológicos en las células y provocar daño tisular. Este acontecimiento parece producirse de manera más espectacular en las neuronas, por su alta tasa de actividad metabólica, y por tanto, parece estar relacionado con una serie de procesos, enfermedades y síndromes degenerativos, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y esquizofrenia. Los tratamientos que conducen a una potenciación de los mecanismos antioxidativos pueden ralentizar la progresión de algunas de las enfermedades mencionadas.

Se sabe que durante el envejecimiento normal el cerebro sufre alteraciones morfológicas y funcionales que afectan a los árboles dendríticos, sinapsis, neurotransmisión, circulación y metabolismo, y estos cambios se ven reflejados en los sistemas motor y sensorial, en el sueño, memoria y aprendizaje. Entre los cambios neuronales producidos por la edad se incluyen la disminución de la homeostasis del Ca²⁺ y de la sensibilidad de los sistemas, dopaminérgico, colinérgico, opiáceo y de catecolaminas. Cada vez más, parece que en estas alteraciones tiene que ver una mayor susceptibilidad a los efectos a largo plazo del EO, disfunción mitocondrial (que aumenta con la edad) y daño por inflamación.

Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE)

El retículo endoplásmico (RE) es el lugar para la síntesis de proteínas y cambios postraduccionales para el correcto plegamiento de las proteínas, es la ruta de transporte común para suministrar proteínas a su destino apropiado dentro de la célula y es también un depósito de Ca²⁺. La alta concentración de Ca²⁺ que hay en el lumen del RE respecto a la concentración en el citoplasma celular es importante tanto para señalización celular como para el correcto procesamiento de las proteínas de nueva síntesis. El RE ejerce el control de calidad sobre las proteínas, asegurando un procesamiento correcto del producto final que es crucial para el funcionamiento normal de la célula. Sólo las proteínas que por las modificaciones post-traduccionales se pliegan correctamente pasan al aparato de Golgi, mientras que aquéllas que no han terminado su plegamiento o están plegadas incorrectamente quedan retenidas en el RE para terminar el proceso o se señalizan para su degradación. Además de esta función de plegamiento de proteínas, el RE es el lugar de síntesis de esteroles y lípidos. Cualquier alteración en alguno de estos procesos es causa de ERE.

Distintas situaciones fisiológicas o patológicas que afecten al plegamiento proteico y/o a la homeostasis del Ca²⁺, como privación de glucosa, infecciones virales o la expresión de proteínas mutantes incapaces de plegarse, pueden ser causa de ERE por acumulación de proteínas mal plegadas, y entonces se produce en las células una respuesta a este estrés, activándose la respuesta a proteínas no-plegadas (Unfolded Protein Response, UPR). El plegamiento de proteínas in vivo requiere una maquinaria de plegamiento en el RE que se puede sobrecargar, resultando en una acumulación de proteínas mal plegadas y entonces se activa la respuesta UPR para tratar de restablecer el estado normal en el RE.

En estos casos, se puede aumentar la capacidad de plegamiento del RE aumentando la expresión de su maquinaria de plegamiento y de chaperonas como BiP/GRP78 y GRP94 y aumentando el tamaño del RE y, por otro lado, disminuyendo la carga de proteínas mediante un silenciamiento de la traducción y transcripción y eliminando las proteínas mal plegadas y señalizadas como tal. Cuando estos mecanismos no son capaces de remediar la situación de estrés, el RE inicia una señal de alarma al sistema inmune vía NF-κB, y un ERE excesivo y/o prolongado conduce al "suicidio celular", normalmente por un proceso apoptótico.

Un signo común de las enfermedades neurodegenerativas es la acumulación y los depósitos de proteínas con plegamiento erróneo que afectan a varias rutas de señalización que conducen finalmente a la muerte neuronal. Algunos autores consideran que el estrés del RE está relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas tales como EA, EP, ELA, Huntington y encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos procedimientos para la identificación de compuestos terapéuticos para el tratamiento enfermedades neurodegenerativas, en particular, de enfermedades neurodegenerativas que cursan con estrés oxidativo y/o estrés de retículo endoplásmico y que conducen a la muerte neuronal.

Respuesta Integrada a Estrés (RIE)

Las células eucariotas responden a las proteínas mal plegadas en el RE, privación de aminoácidos o a condiciones oxidantes fosforilando de forma reversible al factor eIF2α. Esta fosforilación inhibe la síntesis general de proteínas promoviendo la expresión de la isoforma 4 del factor activador de la transcripción (ATF4), y activando así la expresión de dianas implicadas en UPR, como Chop. Se trata de una Respuesta Integrada a Estrés (RIE) que regula el metabolismo de aminoácidos y la resistencia al estrés oxidativo; además de adaptar a las células a ERE. De esta manera, ante situaciones de estrés prolongado, la célula puede derivar hacia procesos apoptóticos y/o autofágicos.

Gen DDIT3 (DNA-Damage-Inducible Transcript 3)

El gen DDIT3, (DNA-Damage-Inducible Transcript 3), también conocido como CHOP-10 (CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) Homologous Protein -10), CHOP, CEBPZ (CEBPζ), GADD153 (Growth Arrest and DNA-Damage inducible gene 153) o MGC4154 codifica para una proteína que se conoce habitualmente como Chop.

Chop es un factor de transcripción bZip que se activa en respuesta a agentes que alteren de algún modo la maquinaria de plegamiento del RE. Puede formar horno o heterodímeros con otros miembros de la familia C/EBP, pero los heterodímeros no se unen a los sitios clásicos de unión C/EBP, de tal forma que, desde el punto de vista de estos sitios diana, Chop es inhibidor de estos factores de transcripción. Sin embargo, los homodímeros de Chop sí son capaces de unirse a otras secuencias específicas diferentes de las clásicas C/EBP. Así, Chop tiene un papel dual inhibiendo la función de C/EBPs y activando otros genes diana diferentes. Se ha visto que la sobreexpresión de CHOP y la microinyección de la proteína Chop conduce a parada del ciclo celular y/o a apoptosis, mientras que ratones deficientes en este gen muestran apoptosis reducida en respuesta a ERE, y deficiencias en su expresión pueden proteger a las células de...

1. Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

       y

b) detectar la expresión del gen reportero;

       en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

2. Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés oxidativo o estrés de retículo endoplasmático en una célula que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

       y

b) detectar la expresión del gen reportero;

       en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

3. Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

a) poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y

c) detectar la expresión del gen reportero;

       en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas, a tapsigargina o a una bajada de temperatura.

6. Método según la reivindicación 5, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

7. Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de:

a) poner una célula en condiciones de estrés de estrés oxidativo, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y

c) detectar la expresión del gen reportero;

       en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

8. Método según las reivindicación 7, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido o de radicales libres en la célula.

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa o agua oxigenada.

10. Una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

11. Construcción génica según la reivindicación 10, donde dicha variante presenta el polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2.

12. Construcción génica según la reivindicación 10 u 11, que comprende, adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de un gen de interés operativamente unida.

13. Un vector de expresión que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Una célula que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o un vector de expresión según la reivindicación 13.

15. Una célula que expresa una construcción génica que comprende

a) la región promotora del gen DDIT3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

b) un gen de interés acoplado operativamente a dicha región promotora.

16. Célula según la reivindicación 15, donde dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

17. Una célula según las reivindicaciones 14 a 16 donde dicha célula es una célula SK-N-MC.

18. Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende

a) introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés;

b) someter la célula a condiciones que generan estrés de retículo endoplásmico y, opcionalmente,

c) recuperar de la célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.

19. Un método según la reivindicación 18, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas.

21. Método según la reivindicación 20, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

22. Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende

a) introducir en una célula una construcción que comprende que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés,

b) someter la célula a condiciones que generan estrés oxidativo y, opcionalmente,

c) recuperar de dicha célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.

23. Método según las reivindicación 22, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido en la célula.

24. Método según la reivindicación 23, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.

25. Un animal no-humano transgénico que contiene, insertado en su genoma, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.