Un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo que comprende al menos una construcción transgénica que comprende el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2,

un transgén controlado por un promotor/ potenciador específico de linfocitos B

Campo de la Invención

Esta invención está relacionada con los métodos para aumentar la supervivencia de linfocitos B en animales que han sufrido una linfopoyesis a corto plazo. Esta invención está relacionada también con los métodos para aumentar la supervivencia de linfocitos B en animales transgénicos que expresan una inmunoglobulina exógena o locus de transgén de una cadena de inmunoglobulina para aumentar la producción de inmunoglobulinas. Está invención está relacionada además con un método para aumentar de forma selectiva la supervivencia de linfocitos B exógenos que expresan cualquier locus de transgén de inmunoglobulina en linfocitos B endógenos que no expresan el locus del transgén mediante expresión selectiva de cualquier inhibidor de la apoptosis sólo dentro de los linfocitos B exógenos que expresan la inmunoglobulina codificada en el transgén, pero no dentro de los linfocitos B que expresan inmunoglobulina endógena. Este método permite el aumento de expresión y producción de los productos codificados por el transgén en la inmunoglobulina producida de forma endógena del animal transgénico. La invención también proporciona un nuevo inhibidor de la apoptosis, bcl2 de conejo.

Antecedentes de la técnica

La generación de ratones que expresan anticuerpos quiméricos humano-ratón se han descrito en Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998). La generación de ratones que expresan polipéptidos de inmunoglobulina humana se han descrito en Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989); Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13 (1):65-93 (1995); y Bruggemann et al:, Curr. Opin. Biotechnol., 8(4): 455-8 (1997). La generación de ratones transgénicos utilizando un clon de BAC se ha descrito en Yang et al., Nat. Biotechnol. 15: 859-65 (1997). La generación de vacas que expresan anticuerpos humanos se ha descrito en Kuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002).

La transgénesis en animales se ha descrito en Wall RJ, Theriogenology 57(1): 189-201 (2002). La generación de conejos transgénicos se ha descrito en Fan, J. et al., Pathol Int. 49: 583-94 (1999); y Brem et al., Mol. Reprod. Dev. 44: 56-62 (1996). La producción de pollos transgénicos se ha descrito en Etches et al., Methods in Molecular Biology 62: 433-450 (1997); y Pain et al., Cells Tissues Organs 165(3-4): 212-9 (1999); y Sherman et al., Nature Biotech 16:1050-1053 (1998).

Los conejos con expresión anómala de inmunoglobulina se han descrito en Chen et al., J. Immunol. 150: 2783-2793 (1993); y Lamoyi E, y Mage RG., J. Exp. Med. 162:1149-1160 (1985). Un pollo gamma-globulinémico se ha descrito en Frommel et al., J. Immunol. 105(1): 1-6 (1970); y Benedict

et al., Adv. Exp. Med. Biol. 88(2): 197-205 (1977).

La clonación de animales a partir de células se ha descrito en T. Wakayama et al., Nature 394:369-374 (1998);

J. B. Cibelli et al., Science 280:1256-1258 (1998); J.B. Cibelli et al., Nature Biotechnology 16:642-646 (1998); A.

E. Schnieke et al., Science 278: 2130-2133 (1997); y K.H. Campbell et al., Nature 380: 64-66 (1996). El clonaje por transferencia nuclear de conejos se ha descrito en Stice et al., Biology of Reproduction 39: 657-664 (1988); Challah-Jacques et al., Cloning and Stem Cells 8(4):295-299 (2003).

La producción de animales transgénicos no humanos que expresan transloci de inmunoglobulina humana (humanizada) y la producción de anticuerpos a partir de dichos animales transgénicos se ha descrito en detalle en la Publicación PCT Nº. WO 92/03918, WO 02/12437, y en la patente Estadounidense Nº. 5.545.807, 5.814.318; y 5.570.429. La recombinación homóloga de huéspedes de mamífero quiméricos se muestra en la patente Estadounidense Nº 5.416.260. Un método para introducir DNA en un embrión se describe en la patente Estadounidense Nº 5.567.607. El mantenimiento y expansión de las células madre embrionarias se describe en la patente Estadounidense Nº 5.453.357.

Las actividades de escisión de las proteínas víricas que contienen las secuencias del péptido 2A se ha descrito en Palmenberg et al., Virology 190:754-762 (1992); Ryan et al., J Gen Virol 72:2727-2732 (1991); Donnelly et al., J Gen Virol 82: 1.027-1041 (2001); Donnelly et al., J Gen Virol 82:1013-1025 (2001); Szymaczak et al., Nature Biotech

22(5):589-594 (2004).

Hasta el momento, los estudies de la contribución relativa de los mecanismos de supervivencia celular regulados por el inhibidor de la apoptosis bcl2, se han realizado principalmente en ratones. El efecto de la expresión de bcl-2 en la supervivencia de la célula se ha descrito en McDonnell et al., Cell, 57:79-88, (1989); Strasser et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 166:175-181, (1990); Knott et al., Hybridoma, 15 (5):365-371, (1996); Smith et al., J. Exp. Med., 191(3):475784 (2000); Strasser et al., PNAS, 88:8661-8665, (1991) y Kumar et al., Immunology Letters, 65:153-159, (1999). El efecto de la expresión del inhibidor de la apoptosis bcl-xL en la supervivencia de las células se ha descrito en Takahashi et al., J. Exp. Med., 190(3): 399-409 (1999).

El mecanismo de desarrollo de los linfocitos B como una linfopoyesis B continua y a corto plazo se ha revisado en Lanning D, Osbome BA, Knight, KL., Los genes de la inmunoglobulina y la generación de repertorios de anticuerpos en vertebrados superiores: un papel clave de GALT. Biología molecular de los linfocitos B. Alt F.W., Honjo T, Nueberger, M. S., Eds. Elsevier, Londres, pág. 443 (2004); y Flajnik M.F., Análisis comparativo de los genes de inmunoglobulina: sorpresas y maravillas. Nat. Rev. Immunol. 2:688, (2002).

Ya que la producción de anticuerpos en animales transgénicos más grandes como conejos, pollos, ovejas y vacas se ve favorecido desde un punto de vista de rendimiento de los anticuerpos, la creación de animales

fundadores más grandes con inhibición de la apoptosis en linfocitos B que expresan mayores cantidades de productos codificados por transgenes es altamente deseable. No obstante, el desarrollo de los linfocitos B difiere significativamente en las especies que padecen una linfopoyesis a corto plazo (como conejos, pollos, ovejas y vacas) en relación a los animales caracterizados por una linfopoyesis B continua, (como en los ratones). Así, no queda claro si los inhibidores de la apoptosis pueden utilizarse con el mismo éxito en los animales que experimentan una linfopoyesis a corto plazo como en los animales estudiados en más detalle con linfopoyesis B continua, o, cual será el impacto de los inhibidores de la apoptosis en la producción de anticuerpos y /o afinidades de anticuerpos.

Resumen de la Invención

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende un nuevo polipéptido inhibidor de la apoptosis, a saber, el polipéptido bcl-2 de conejo con Id. de Sec. Nº: 5. En una realización particular, la invención proporciona una molécula quimérica que comprende el polipéptido bcl-2 de conejo de Id. de Sec. Nº: 5 fusionado a una secuencia heteróloga de aminoácidos. En otra realización, la secuencia heteróloga de aminoácidos es una secuencia de epítopos. En otra realización, la secuencia heteróloga de aminoácidos es una secuencia de inmunoglobulina. En aún otra realización, la secuencia de inmunoglobulina es una región Fc de una inmunoglobulina. La

presente invención también proporciona secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido bcl-2 de conejo de Id. de Sec. Nº: 5. En un aspecto, la invención proporciona un vector, un casete de expresión o construcción de expresión transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido bcl-2 de conejo. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada transformada con las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido bcl-2 de conejo de Id. de Sec. Nº: 5. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada transformada con el vector, un casete de expresión o construcción de expresión transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido bcl-2 de conejo.

En algunos aspectos, cualquier gen inhibidor de la apoptosis puede utilizarse, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis seleccionado de entre el grupo que consiste en bcl-2, mutantes de la caspasa-9-DN, baculovirus p35, caspasa-9S, crmA, z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, B- D-fmk, z-YVADfmk, Bcl-xL, Mcl-1, XIAP, TIAP, KIAP, NAIP, cIAP1, cIAP2, API1, API2, API3, API4, HIAP1, HIAP2, MIHA, MIHB, MIHC, ILP, ILP-2, TLAP, survivina,...

1. Un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo que comprende al menos una construcción transgénica que comprende el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2, un transgén controlado por un promotor/ potenciador específico de linfocitos B.

2. Un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo que comprende al menos una construcción transgénica que comprende el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2, un transgén controlado por un promotor/ potenciador específico de linfocitos B y al menos una inmunoglobulina exógena o locus transgénica de una cadena de inmunoglobulina.

3. El animal transgénico no humano de la reivindicación 2 en el que dicha inmunoglobulina exógena o cadena de inmunoglobulina es una secuencia de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina humana(humanizada).

4. El animal transgénico no humano de la reivindicación 1 o 2 seleccionado del grupo que consiste en conejos, aves, pollos, ovejas, cabras, vacas, cerdos, caballos y burros.

5. Una construcción de expresión transgénica para su utilización en un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo, que comprende un transgén que codifica una proteína de fusión que comprende secuencias de polipéptido en el siguiente orden: a) una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina; b) un péptido autoescindible; c) el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2 y un promotor específico de linfocitos B de dicho animal

transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo; y opcionalmente, d) una diana de escisión por una proteasa entre a) y b).

6. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 5 en la que dicha diana de escisión por una proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las dianas de las proteasas de aspártico, proteasas de cisteína, metaloproteasas, proteasas de serina y proteasas de treonina.

7. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 5 en la que dicha diana de escisión por una proteasa es la diana de escisión de la furina.

8. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 5 en la que dicho fragmento de inmunoglobulina es un fragmento de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina humana (humanizada).

9. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 5 en la que dicho péptido autoescindible se deriva de los péptidos virales 2A/ 2B o tipo 2A/ 2B.

10. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 9 en la que dicho virus se selecciona de entre el grupo que consiste en la familia de virus picornaviridae, familia de virus de la rinitis A equina (ERAV), familia de virus de insecto tipo picornavirus y de la familia de rotavirus de tipo C.

11. La construcción de expresión transgénica de la reivindicación 10 en la que dicho virus se selecciona de entre el grupo que consiste en el virus de la fiebre aftosa

(FMDV), el virus de la rinitis A equina (ERAV) y el virus asigna de Thosea (TaV).

12. La construcción de expresión transgénica de las reivindicaciones 1 a 11 en la que dicho bcl-2 de mamífero se selecciona de entre el grupo que consiste en el bcl-2 humano, bcl-2 murino y bcl-2 de conejo.

13. Una célula huésped aislada transformada con la construcción de expresión transgénica de la reivindicación 5 para su utilización en un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo.

14. Un método para potenciar de forma selectiva la expresión de una inmunoglobulina exógena o cadena de inmunoglobulina en un linfocito B exógeno de un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo, que comprende la introducción en dicho animal de una construcción transgénica que codifica una proteína de fusión que comprende unas secuencias polipeptídicas en el siguiente orden: a) una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina; b) un péptido autoescindible; c) el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2, y opcionalmente; d) una diana de escisión por una proteasa entre a) y b), en el que se potencian la supervivencia de la célula B exógena y la producción de la inmunoglobulina exógena.

15. El método de la reivindicación 14 en el que dicha inmunoglobulina exógena o cadena de inmunoglobulina es una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina humana (humanizada).

16. El método de la reivindicación 14 en el que dicha

diana de escisión por una proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las dianas de las proteasas de aspártico, proteasas de cisteína, metaloproteasas, proteasas de serina y proteasas de treonina.

17. El método de la reivindicación 14 en el que dicha diana de escisión por una proteasa es la diana de escisión de la furina.

18. El método de la reivindicación 14 en el que dicho gen de un péptido autoescindible se obtiene del 2A/ 2B o tipo 2A/ 2B viral.

19. El método de la reivindicación 14 en el que dicho virus se selecciona de entre el grupo que consiste en la familia de virus picornaviridae, la familia de virus de la rinitis A equina (BRAY), la familia de virus de insectos tipo picornavirus y de la familia de rotavirus tipo C.

20. El método de la reivindicación 14 en el que dicho virus se selecciona de entre el grupo que consiste en el virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la rinitis A equina (ERAV) y el virus asigna de Thosea (TaV).

21. El método de la reivindicación 14 en el que dicho animal transgénico no humano se selecciona de entre el grupo que consiste en roedores, primates, conejos, aves, vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos y burros.

22. Un animal transgénico no humano sometido a linfopoyesis a corto plazo que comprende al menos una construcción transgénica que codifica una proteína de fusión que comprende unas secuencias polipeptídicas en el siguiente orden: a) una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina;

b) un péptido autoescindible; c) el inhibidor de la apoptosis de mamíferos bcl-2, y opcionalmente; d) una diana de escisión por una proteasa entre a) y b), en el que se expresa dicha proteína de fusión. 23. El animal transgénico no humano de la reivindicación 22 en el que dicho animal se selecciona de entre el grupo que consiste en roedores, primates, conejos, aves, vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos y burros.