Vacuna de ADN adecuada para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable,

en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano atenuado

Vacunas de ADN contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilización de las mismas.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional US para la patente nº de serie 60/457.009 presentada el 24 de marzo de 2003, cuya exposición está incorporada en la presente memoria como referencia.

Derechos gubernamentales

La presente invención fue realizada con la ayuda gubernamental con las subvenciones nº 1R01CA83856-01 y CA83856 de los National Institutes of Health, subvención nº 9RT00-17 del Tobacco Related Disease Research Program, y las subvenciones nº DAMD17-02-1-0137 y nº DAMD17-02-1-0562 del Department of Defense. El gobierno presenta determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifican moléculas adecuadas, eficaces, para provocar una respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Más específicamente la presente invención se refiere a vacunas de ADN que codifican un inhibidor asociado al cáncer de la proteína de la familia Apoptosis (IAP) y un producto génico inmunoactivo. La presente invención se refiere también a procedimientos de utilización de las vacunas de ADN para inhibir el crecimiento del tumor.

Antecedentes de la invención

Se han utilizado vacunas para proporcionar una protección de larga duración contra numerosas enfermedades mediante la administración muy limitada de un agente profiláctico que estimula un sistema inmunitario del organismo para destruir organismos patógenos de enfermedades antes de que puedan proliferar y producir un efecto patológico. Se describen varios procedimientos para vacunas y vacunaciones en Bernard R. Glick y Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, segunda edición, ASM Press págs. 253-276 (1998).

La vacunación es una manera de provocar al sistema inmunitario del propio cuerpo para buscar y destruir un agente infeccioso antes de que produzca un respuesta patológica. Por lo general, las vacunas son agentes infecciosos vivos, pero atenuados (virus o bacterias) o una forma destruida del agente. Una vacuna consistente en bacterias o virus vivos debe ser apatógena. Por lo general, un cultivo bacteriano o vírico se atenúa (debilita) por tratamiento físico o químico. Aunque el agente es avirulento, puede provocar todavía una respuesta inmunitaria en un paciente tratado con la vacuna.

Los antígenos, que pueden ser macromoléculas específicas o un agente infeccioso, provocan una respuesta inmunitaria. Estos antígenos son generalmente proteínas, polisacáridos, lípidos o glucolípidos, que son reconocidos como "extraños" por los linfocitos conocidos como linfocitos B y linfocitos T. La exposición de ambos tipos de linfocitos a un antígeno provoca una división celular rápida y una respuesta de diferenciación, dando como resultado la formación de clones de los linfocitos expuestos. Los linfocitos B producen células de plasma, que a su vez, producen proteínas denominadas anticuerpos (Ab) que se unen selectivamente a los antígenos presentes en el agente infeccioso, neutralizando o inactivando de este modo el patógeno (inmunidad humoral). En algunos casos, la respuesta del linfocito B requiere la asistencia de linfocitos T CD4 colaboradores.

El clon del linfocito T especializado que se forma en respuesta a la exposición al antígeno, es un linfocito T citotóxico (LTC), que puede unirse a patógenos y eliminarlos y a tejidos presentadores de antígeno (inmunidad mediada por células o celular). En algunos casos, una célula presentadora de antígeno (CPA) tal como un dendrocito, desarrollará un patógeno u otra célula extraña por endocitosis. La CPA procesa a continuación los antígenos procedentes de las células y presenta estos antígenos en forma de un complejo de histocompatibilidad molécula:péptido al receptor de linfocitos T (RLT) en los LTC, estimulando de este modo una respuesta inmunitaria.

La inmunidad humoral caracterizada por la formación de anticuerpos específicos es generalmente la más eficaz contra las infecciones bacterianas agudas y repiten infecciones procedentes de virus, mientras que la inmunidad mediada por células es más eficaz contra la infección vírica, la infección bacteriana intracelular crónica y la infección micótica. La inmunidad celular es también conocida porque protege contra cánceres y es responsable del rechazo de trasplantes de órganos.

Los anticuerpos contra antígenos procedentes de infecciones anteriores permanecen detectables en la sangre durante períodos muy prolongados, proporcionando de este modo un medio de determinación antes de la exposición al patógeno. Durante la reexposición al mismo patógeno, el sistema inmunitario previene eficazmente la reinfección eliminando el agente patógeno antes de que pueda multiplicarse y produzca una respuesta patógena.

La misma respuesta inmunitaria que provocaría un patógeno puede también a veces ser producida por un agente apatógeno que presenta el mismo antígeno como patógeno. De esta manera, el paciente puede ser protegido contra la exposición posterior al patógeno sin haber combatido previamente una infección.

No obstante, no todos los agentes infecciosos pueden cultivarse e inactivarse fácilmente, a medida que se necesita para la formación de la vacuna. Las técnicas modernas de ADN recombinante han permitido la modificación genética de nuevas vacunas para buscar superar esta limitación. Pueden crearse agentes infecciosos que carecen de genes patógenos, permitiendo así una forma viva, no virulenta del organismo que va a utilizarse como vacuna. También es posible modificar genéticamente un organismo relativamente no patógeno tal como E. coli para presentar los antígenos de la superficie celular de un vehículo patógeno. El sistema inmunitario de un paciente vacunado con dicho vehículo transformado es "engañado" en la formación de anticuerpos contra el patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno pueden modificarse genéticamente y expresarse en una especie apatógena y las proteínas antigénicas pueden aislarse y purificarse para producir una "vacuna subunitaria". Las vacunas subunitarias tienen la ventaja de ser estables, seguras y químicamente bien definidas; sin embargo, su producción puede ser de coste prohibitivo.

En los últimos años ha aparecido una nueva metodología para vacunas, denominada a grandes rasgos inmunización genética. En esta metodología, un gen que codifica un antígeno de un agente patógeno se inserta de manera operable en las células en el paciente que va a ser inmunizado. Las células tratadas, preferentemente células presentadoras de antígeno (CPA) tales como los dendrocitos, se transforman y producen las proteínas antigénicas del patógeno. Estos antígenos producidos in vivo desencadenan a continuación la respuesta inmunitaria deseada en el hospedador. El material genético utilizado en dichas vacunas genéticas puede ser un montaje de ADN o de ARN. Con frecuencia el polinucleótido que codifica el antígeno se introduce en combinación con otras secuencias activadoras del polinucleótido para aumentar la inserción, replicación o expresión del gen.

Las vacunas de ADN que codifican genes de antígeno pueden introducirse en las células hospedadoras del paciente mediante varios sistemas de administración. Estos sistemas de administración incluyen sistemas de administración procariótica y vírica. Por ejemplo, una metodología consiste en utilizar un vector vírico, tal como un virus de vacuna que incorpora el nuevo material genético, para inocular las células hospedadoras. Alternativamente, el material genético puede incorporarse en un vector plásmido o puede suministrarse directamente a las células hospedadoras como un polinucleótido "desnudo", es decir simplemente como ADN purificado. Además, el ADN puede transfectarse de manera estable en bacterias atenuadas tal como Salmonella typhimurium. Cuando un paciente es vacunado por vía bucal con la Salmonella transformada, las bacterias son transportadas a parches de Peyer en el intestino (es decir, tejidos linfoides secundarios), que a continuación estimulan una respuesta inmunitaria.

Las vacunas de ADN proporcionan una oportunidad para inmunizar contra enfermedades que no son producidas por patógenos tradicionales, tales como las enfermedades genéticas y el cáncer. Por lo general, una vacuna genética contra el cáncer introduce en las CPA un gen...

1. Vacuna de ADN adecuada para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano atenuado.

2. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN codifica operativamente una proteína survivina seleccionada de entre el grupo constituido por (a) survivina humana natural que presenta la secuencia de restos de aminoácidos de SEC ID nº 2, (b) un homólogo inmunógeno de survivina humana natural que presenta una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la SEC. ID. nº: 2, (c) una variante de corte y empalme de survivina humana que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 23 de restos de aminoácidos, (d) una variante de corte y empalme de la survivina humana que presenta la secuencia de restos de aminoácidos de SEC ID nº 24, y (e) un fragmento de una proteína survivina que se une a una molécula MCH de clase I y es reconocido por los linfocitos T citotóxicos.

3. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN codifica operativamente un homólogo inmunógeno de survivina humana natural que presenta una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95% idéntica a la SEC. ID. nº: 2.

4. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el producto génico inmunoactivo codificado operativamente por el montaje de ADN es una citocina o un ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural.

5. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en la que la citocina se selecciona de entre el grupo constituido por una quimiocina, una hematopoyetina, un interferón un factor estimulante de células destructoras naturales y un factor de inducción de la producción de citocinas.

6. Vacuna de ADN según la reivindicación 5, en la que la citocina es la CCL21.

7. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en la que el ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural es una proteína inducible por estrés seleccionada de entre el grupo constituido por MICA humana, MICB humana, ULBP1 humana, ULBP2 humana, y ULBP3 humana.

8. Vacuna de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector bacteriano atenuado se selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de Bacillus, especies de Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, especies de Campylobacter y especies de Listeria atenuadas.

9. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^- de Salmonella typhimurium.

10. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^-, dam^- de Salmonella typhimurium.

11. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 1 y SEC. ID. nº 3.

12. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos un producto génico inmunoactivo comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 7, SEC. ID. nº 11, SEC. ID. nº 13, SEC. ID. nº 15, SEC. ID. nº 17, SEC. ID. nº 19 y SEC. ID. nº 21.

13. Vacuna de ADN según la reivindicación 11 ó 12, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector de Salmonella typhimurium atenuada.

14. Utilización de un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una vacuna de ADN destinada a inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado operativamente en un vector bacteriano atenuado.

15. Utilización de un montaje de ADN que codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una vacuna de ADN destinada a vacunar a un mamífero contra el cáncer, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado operativamente en un vector bacteriano atenuado.

16. Utilización según la reivindicación 14 ó 15, en la que el producto génico inmunoactivo codificado por el montaje de ADN es una citocina o un ligando para un receptor de la superficie de la célula destructora natural.

17. Utilización según la reivindicación 14 ó 15, en la que el mamífero es un ser humano.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en la que el vector bacteriano atenuado se selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de Bacillus, especies de Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, especies de Campylobacter y especies de Listeria.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^- de Salmonella typhimurium.

20. Utilización según la reivindicación 18, en la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa AroA^-, dam^- de Salmonella typhimurium.

21. Artículo de fabricación que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, embalado en un recipiente estéril, herméticamente sellado, presentando el recipiente una etiqueta fijada al mismo, llevando la etiqueta material impreso que identifica la vacuna y que proporciona información útil para un individuo que administra la vacuna a un paciente.