VACUNA DE SUB-UNIDAD DE LAWSONIA INTRACELLULARIS.

Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis inmunogénica o una parte de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína,

teniendo dicha secuencia de ácido nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 90%, preferiblemente el 92%, más preferiblemente el 94% y aún más preferiblemente el 96% con la secuencia de ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1

Vacuna de sub-unidad de Lawsonia intracellularis.

La presente invención se refiere, entre otros, a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de Lawsonia intracellularis novedosas, a fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y portadores recombinantes vivos que comprenden estas secuencias, a células hospedadoras que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y portadores recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos y a su uso para la preparación de vacunas, a vacunas para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis y métodos para la preparación de las mismas y a ensayos de diagnóstico para la detección de ADN de Lawsonia intracellularis, para la detección de antígenos de Lawsonia intracellularis y para la detección de anticuerpos frente a Lawsonia intracellularis.

La enteropatía proliferativa porcina (PPE o PE) se ha vuelto una enfermedad importante de la industria porcina moderna en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15% al 50% de las piaras en crecimiento y hasta el 30% de los animales individuales en piaras problema establecidas. Actualmente las pérdidas económicas anuales se han estimado en UStextdollar 5-10 en costes de alimentación y de mantenimiento adicionales por cerdo afectado. PPE es un grupo de afecciones crónicas y agudas de signos clínicos ampliamente diferentes (muerte, animales pálidos y anémicos, diarrea acuosa, oscura o rojo brillante, depresión, apetito reducido y renuencia a moverse, crecimiento retardado y FCR aumentado). Sin embargo, existen dos características constantes. La primera, un cambio patológico sólo visible a la necropsia, es un engrosamiento de la mucosa del intestino delgado y el colon. La segunda es la aparición de bacterias pequeñas curvas intracitoplasmáticas en los enterocitos del intestino afectado. Estas bacterias actualmente se han establecido como el agente etiológico de PPE y se han denominado Lawsonia intracellularis.

A través de los años se ha observado que Lawsonia intracellularis afecta virtualmente a todos los animales incluyendo monos, conejos, hurones, hámsteres, zorros, caballos y otros animales tan diversos como avestruz y emú. Lawsonia intracellularis es una bacteria gram negativa flagelada que se multiplica sólo en enterocitos eucariota y no se ha descrito cultivo libre de células. Para persistir y multiplicarse en la célula, Lawsonia intracellularis tiene que penetrar células de las criptas en división. La bacteria se asocia con la membrana celular y rápidamente entra en el enterocito a través de una vacuola de entrada. Después ésta se degrada rápidamente (en las 3 horas siguientes) y las bacterias crecen y se multiplican libremente en el citoplasma. El mecanismo mediante el cual las bacterias provocan que las células infectadas no maduren, continúen experimentando la mitosis y formen células de las criptas hipoplásicas aún no se comprende.

La compresión actual de la infección, el tratamiento y el control de la enfermedad por Lawsonia intracellularis ha estado impedida por el hecho de que Lawsonia intracellularis no se puede cultivar en medios libres de células. Aunque existen informes de co-cultivo satisfactorio de Lawsonia intracellularis en enterocitos de rata, esto no ha conducido al desarrollo de vacunas inactivadas para combatir Lawsonia intracellularis, aunque claramente existe una necesidad de tales vacunas.

El documento EP 1 219 711 (cedido a AKZO NOBEL NV) describe secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de membrana exterior de Lawsonia intracellularis y fragmentos inmunogénicos para uso como vacunas frente a Lawsonia intracellularis. El documento WO0226250 (cedido a la Universidad de Arizona) describe vacunas frente a ileitis proliferativa que contienen sub-unidades inmunogénicas protectoras de Lawsonia intracellularis.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna novedosa para combatir la infección por Lawsonia intracellularis.

Actualmente se ha observado de forma sorprendente, que Lawsonia intracellularis produce una proteína novedosa que es capaz de inducir inmunidad protectora frente a Lawsonia intracellularis. Esta proteína se denominará la proteína de 31,0 kD. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se presenta en el identificador de secuencia SEC ID Nº: 2. El gen que codifica esta proteína se ha secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEC ID Nº: 1.

Otras proteínas encontradas se denominarán la proteína de 24,8 kD, de 76,7 D, de 56,8 kD, de 28,8 kD y de 31,4 kD. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se presentan en los identificadores de secuencia SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10 y 12. Los genes que codifican estas proteínas se han secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en los identificadores de secuencia SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9 y 11.

En la técnica se conoce que muchas secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar la misma proteína. Este fenómeno se conoce comúnmente como titubeo en la segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente el 30% para dos secuencias de ácido nucleico que todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de aproximadamente el 70% todavía pueden codificar la misma proteína.

Por tanto, una realización se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifican un fragmento inmunogénico de esa proteína, donde esas secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas tienen un nivel de homología con la secuencia del ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 de al menos el 90%.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene una homología de al menos el 92%, preferiblemente el 94% y más preferiblemente el 95% con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1. Un nivel de homología del 98% o incluso del 100% es aún más preferido.

El nivel de homología de nucleótidos se puede determinar con el programa informático BLAST 2 SECUENCES seleccionando el sub-programa: BLASTN que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/?blast/b12seq/b12.html.

Una referencia de este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Los parámetros usados son los parámetros por defecto: Recompensa por una coincidencia: + 1. Penalización por una falta de coincidencia: -2. Hueco abierto: 5. Extensión de hueco: 2. disminución_x de Hueco 50.

Otro enfoque para decidir si determinada secuencia de ácido nucleico es o no una secuencia de ácido nucleico de acuerdo la invención se refiere a la cuestión de si esa determinada secuencia de ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID Nº: 1.

Si una secuencia de ácido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID Nº: 1, se considera que es una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La definición de condiciones rigurosas se deduce a partir de la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138: 267-284.)

Tm = [81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61(% formamida) - 500/L-1ºC/1% de falta de coincidencia

En esta fórmula, M es molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares de bases.

Las condiciones rigurosas son aquellas condiciones en las cuales las secuencias de ácido nucleico o fragmentos de las mismas aún se hibridan, si tienen una falta de coincidencia de un máximo del 10%, a la secuencia de ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1.

Ya que la presente invención describe secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de Lawsonia intracellularis novedosas, actualmente es posible obtener por primera vez estas proteínas en cantidades suficientes. Esto se puede realizar,...

1. Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis inmunogénica o una parte de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 90%, preferiblemente el 92%, más preferiblemente el 94% y aún más preferiblemente el 96% con la secuencia de ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1

2. Fragmento de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, bajo el control de un promotor unido funcionalmente.

4. Portador recombinante vivo que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3 o un portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Proteína de Lawsonia intracellularis, comprendiendo dicha proteína inmunogénica una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90%, preferiblemente el 92%, más preferiblemente el 94% y aún más preferiblemente el 96% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID Nº: 2 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.

7. Proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para uso en una vacuna.

8. Uso de una proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para la preparación de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis.

9. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada por que la misma comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, un portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 5 o una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que la misma comprende un adyuvante.

11. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada por que la misma comprende un antígeno adicional obtenido a partir de un virus o micro-organismo patógeno para cerdos o información genética que codifica dicho antígeno.

12. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que dicho virus o micro-organismo patógeno para los cerdos se selecciona entre el grupo de virus de Pseudorrabia, virus de influenza Porcina, parvo virus Porcino, virus de gastroenteritis Transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.

13. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada por que la misma comprende anticuerpos frente a una proteína de acuerdo con la reivindicación 6.

14. Método para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 9-13, comprendiendo dicho método la mezcla de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, un portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 5, una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 o anticuerpos frente a una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Ensayo de diagnóstico para la detección de ADN específico de Lawsonia intracellularis caracterizado por que el ensayo comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento de la misma que tiene una longitud de al menos 12, preferiblemente 15 y más preferiblemente 18 nucleótidos.

16. Ensayo de diagnóstico para la detección de anticuerpos frente a Lawsonia intracellularis, caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína o un fragmento de la misma como se define en la reivindicación 6.

17. Ensayo de diagnóstico para la detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis, caracterizado por que dicho ensayo comprende anticuerpos frente a una proteína o un fragmento de la misma como se define en la reivindicación 6.