Composición de vacuna que comprende un patógeno bacteriano muerto,

secado o atenuado como determinante inmunogénico, en la que el patógeno bacteriano ha sido sometido a estímulos inductores de estrés en la que el estímulo inductor de estrés es la modificación genética del patógeno bacteriano de manera que es inactivado por lo menos un gen represor para un gen de proteína de choque térmico, permitiendo así la expresión constitutiva de proteínas de choque térmico

Vacuna contra patógenos microbianos.

La presente invención se refiere a una vacuna y un método para producir una vacuna. Más concretamente, se proporciona una vacuna que comprende un patógeno microbiano y un método de producción de la misma.

Antecedentes de la invención

Un componente importante de cualquier respuesta inmune humana es la presentación de antígenos a linfocitos T mediante células presentadoras de antígenos (APCs) como los macrófagos, los linfocitos B o las células dendríticas. Hay fragmentos de péptidos de antígenos foráneos presentes en la superficie del macrófago conjuntamente con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), junto con moléculas helper como las moléculas CD4 y CD8. Dichos fragmentos de péptidos antigénicos presentes de esta manera son reconocidos por el receptor de linfocitos T de los linfocitos T. La interacción de los fragmentos de péptidos antigénicos con el receptor de linfocitos T resulta en la proliferación de linfocitos T específicos de antígeno, y en la secreción de linfocinas por parte de los linfocitos T. La naturaleza del fragmento de péptido antigénico que presentan las APCs es crítica al establecer la inmunidad.

Las proteínas de choque térmico (hsps) forman una familia de proteínas altamente conservadas que están ampliamente distribuidas en el reino de las plantas y en el de los animales. En base a sus pesos moleculares, las hsps se agrupan en seis diferentes familias: pequeñas (hsp 20-30kDa); hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; y hsp100. Aunque las hsps fueron originalmente identificadas en las células sometidas a estrés térmico, se ha descubierto que están asociadas a muchas otras formas de estrés, como las infecciones, y por tanto normalmente se denominan proteínas de estrés (SPs).

Los miembros de la familia hsp90 de mamíferos incluyen la hsp90 citosólica (hsp83) y los homólogos de retículo endoplásmico hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94 (Erp99) y gp97, véase por ejemplo Gething et al. (1992) Nature 355:33-45. Los miembros de la familia hsp70 incluyen la hsp70 (p72) y hsp70 (p73) citosólica, el homólogo de retículo endoplásmico BiP (Grp78), y el homólogo mitocondrial hsp70 (Grp75). Los miembros de la familia hsp60 de mamíferos han sido identificados únicamente en la mitocondria.

Las proteínas de estrés están ubicuamente expresadas dentro de las células. Uno de los papeles de las proteínas de estrés es realizar la función de chaperón para péptidos de un compartimento celular a otro y presentar péptidos a las moléculas MHC para la presentación de la superficie celular al sistema inmune. En el caso de células dañadas, las proteínas de estrés también hacen la función de chaperón para péptidos víricos o asociados a tumores a la superficie celular, véase Li and Sirivastave (1994) Behring Inst. Mitt, 94: 37-47 y Suzue et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13146-51.

La función de chaperón de las proteínas de estrés se lleva a acabo a través de la formación de complejos entre proteínas de estrés y fragmentos de péptidos antigénicos, y entre proteínas de estrés y fragmentos de péptidos víricos o asociados a tumores, en una reacción ATP-dependiente. Los fragmentos de péptidos en complejo con las proteínas de estrés forman complejos antigénicos (hspCs) que son capturados por las APCs para proporcionar fragmentos de péptidos antigénicos.

La asociación en complejo de las proteínas de estrés con fragmentos de péptidos también ha sido observada en tejidos normales y no es por tanto un fenómeno específico de los tumores, véase Srivastava (1994) Experimentia 50: 1054-60. Se cree que la inmunogenicidad de los miembros de la familia hsp70, incluyendo grp96, refleja su papel normal en la "presentosoma", funcionando los organelos intracelulares postulados en la carga de las moléculas MHC de Clase I requeridas para su expresión de superficie celular. Esta etapa es esencial para el reconocimiento restringido por MHC de los linfocitos T antígeno-específicos, véase Srivastava et al. (1998) Immunity, Singh-Jasuja et al. J. Exp. Med (2000) 191, 1957.

Hasta hace poco, no ha sido propuesto el uso de complejos hsp-péptidos endógenos derivados de patógenos (hspCs) como vacunas, a pesar del hecho de que las hsps de patógenos han sido ampliamente utilizadas como antígenos y adyuvantes. La publicación de patente internacional PCT nº WO 2001/013944 describe el uso de hspCs endógenos derivados de patógenos y en particular se muestra que hspCs inducidos por estrés proporcionan una buena inmunidad protectora en animales vacunados.

Los miembros de la familia hsp microbiana incluyen las familias Dna J y Dna K y las familias Gro-EL y Gro-ES. En los microbios procarióticos se puede ver que estas familias están codificadas en operones, siendo el gen inicial en el operón un gen de control que suprime la expresión de los genes hsp contenidos dentro del operón.

En Streptomyces y Helicobacter, la expresión del gen hspR suprime la expresión de Dna J y Dna K. Por tanto la deleción del gen hspR resulta en un microbio genéticamente modificado que constitutivamente expresa hsps, véase Bucca et al. (1997) Mol. Microbiol 15:633-45. Han sido identificados operones homólogos en una serie de microbios recientemente secuenciados, incluyendo otras cepas de Streptomyces y Mycobacterium tuberculosis y la ampliamente utilizada cepa de vacuna BCG.

Otros genes represores también pueden controlar la expresión de miembros de la familia del gen hsp y estos también pueden manipularse mediante la ingeniería genética para proporcionar microbios modificados que constitutivamente expresan hspCs que pueden utilizarse para la producción de vacunas y vectores de vacunas. Estos incluyen, pero no se limitan a ellos, los genes de control transcripcional sigma y rho y los genes de proteínas reguladoras de los genes de estrés MerR y HmrR. También hay que comprender que los microbios modificados que contienen los hspCs constitutivos pueden utilizarse directamente como vacunas o como una fuente para aislar los hspCs. Además, la expresión del gen heterólogo o de los genes heterólogos a partir de otro patógeno o de otros patógenos en estos microbios permitiría su uso como vectores de vacunas para la producción simplificada de vacunas basadas en hspC para estos patógenos.

Mientras se miraba al uso de los complejos hsp-péptidos microbianos endógenos inducidos por calor, los complejos hsp-péptidos extraídos fueron comparados con el uso del propio microbio inducido por estrés como vacuna. Inesperadamente, el uso del microbio como vacuna produjo una inmunidad considerablemente mejor en animales vacunados que el uso de complejos hsp-péptidos aislados. Se obtuvieron resultados similares utilizando microbios genéticamente modificados que constitutivamente producían hsps, indicando que se formaron hspCs in situ con polipéptidos microbianos endógenos, incluyendo genes heterogéneos expresados como proteínas recombinantes en el microbio. Los microbios genéticamente modificados también podrían utilizarse como una fuente eficaz para el aislamiento de hspCs para su uso en vacunas de subunidades y de multi-subunidades.

Resumen de la invención

Según la presente invención, se proporciona una vacuna que comprende un patógeno bacteriano muerto, secado o atenuado como un determinante inmunogénico, en la que el patógeno bacteriano has sido sometido a estímulos inductores de estrés en el que el estímulo inductor de estrés es la modificación genética del patógeno bacteriano de manera que por lo menos se inactiva un gen represor para un gen de proteína de choque térmico, permitiendo de ese modo la expresión constitutiva de un gen de proteína de choque térmico.

Preferentemente la modificación genética resulta en la inactivación del gen represor hspR.

Alternativamente la modificación genética resulta en la inactivación de los genes represores de genes de la proteína reguladora de los genes de estrés MerR o HmrR, o los genes del control transcripcional sigma y rho.

Preferentemente el patógeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en Mycobacteria, Salmonella, Vibrio, Streptomyces, Helicobacter, Lactococcus y Listeria.

Preferentemente la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.

Preferentemente el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en; adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs y escualeno.

Preferentemente...

1. Composición de vacuna que comprende un patógeno bacteriano muerto, secado o atenuado como determinante inmunogénico, en la que el patógeno bacteriano ha sido sometido a estímulos inductores de estrés en la que el estímulo inductor de estrés es la modificación genética del patógeno bacteriano de manera que es inactivado por lo menos un gen represor para un gen de proteína de choque térmico, permitiendo así la expresión constitutiva de proteínas de choque térmico.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1 en la que la modificación genética resulta en la inactivación del gen represor hspR.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1 en la que la modificación genética resulta en la inactivación de los genes de las proteínas reguladoras de los genes de estrés MerR o HmrR.

4. Composición de vacuna según la reivindicación 1 en la que la modificación genética resulta en la inactivación de los genes del control de trascripción rho y sigma.

5. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el patógeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en Mycobacteria, Salmonella, Vibrio, Listeria, Streptomyces, Helicobacter y Lactococcus.

6. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.

7. Composición de vacuna según la reivindicación 6, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en; adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs y escualeno.

8. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vacuna es adecuada para la administración mediante inyección.

9. Composición de vacuna según las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición de la vacuna es adecuada para la administración oral.

10. Composición de vacuna según la reivindicación 9, en la que la composición de la vacuna es adecuada para la administración por medio de un formato de administración sin agujas.

11. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de infecciones con un patógeno bacteriano que se proporciona como el determinante inmunogénico en la composición de la vacuna.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es una vacuna profiláctica.

13. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es una vacuna terapéutica.

14. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es administrada mediante inyección.

15. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es administrada mediante un medio de administración sin agujas.

16. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es administrada por vía transdérmica.

17. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es administrada por vía pulmonar.

18. Composición según la reivindicación 11, en la que la vacuna es administrada por vía oral.

19. Método de producción de la composición de una vacuna que comprende un determinante inmunogénico caracterizado porque dicho método comprende las etapas de:

20. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque el gen represor es el gen hspR.

21. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque el gen represor es MerR o HmrR.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en el que las células del patógeno bacteriano son matadas antes de ser usadas en dicha vacuna.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en el que las células del patógeno bacteriano son secadas antes de ser usadas en dicha vacuna.