Método para producir una composición de vacuna que comprende un determinante inmunogénico,

que comprende las etapas de:

- exponer a organismos patógenos fúngicos, protozoarios o procariotas a estímulos inductores de estrés suficientes para inducir la producción de complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos;

- extraer los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos de los organismos tratados; y

- utilizar los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico extraídos como determinante inmunogénico en la preparación de la composición de vacuna

Proteínas del estrés de patógenos extracelulares como vacunas contra agentes infecciosos.

La presente invención se refiere a una vacuna y un método para producir una vacuna, en particular a un método para producir una composición de vacuna que contenga proteínas inducidas por estrés de organismos patógenos extracelulares.

Antecedentes de la invención

Un componente importante de cualquier respuesta inmune humana es la presentación de los antígenos a las células T por las células presentadoras de antígenos (APCs), como los macrófagos, las células B o las células dendríticas. Los fragmentos de péptidos de los antígenos foráneos son presentado sobre la superficie de los macrófagos en combinación con moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), en asociación con moléculas helper, como las moléculas CD4 y CD8. Tales fragmentos de péptidos antigénicos presentados de esta manera son reconocidos por el receptor de las células T de las células T y la interacción de los fragmentos de péptidos antigénicos con el receptor de las células T resulta en una proliferación de las células T específicas de antígeno y la secreción de linfocinas por las células T. La naturaleza del fragmento de péptido antigénico presentado por las APCs resulta crítico en el establecimiento de la inmunidad.

Las proteínas de choque térmico (HSPs) forman una familia de proteínas altamente conservadas que se encuentran ampliamente distribuidas por los reinos animal y vegetal. En base a sus pesos moleculares, las HSPs se agrupan en seis familias diferentes: pequeñas (hsp 20-30 kDa); hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; y hsp100. Aunque las HSPs se identificaron originalmente en células sometidas a estrés térmico, se ha descubierto que se asocian con muchas otras formas de estrés como las infecciones, y son por lo tanto conocidas más comúnmente como proteínas del estrés (SPs). Por motivos prácticos, se utilizarán las iniciales SP para indicar en general las proteínas inducidas a partir de células sometidas a cualquier forma de estrés y las iniciales HSP se utilizarán para indicar aquellas específicamente inducidas por estrés térmico.

Los miembros de la familia hsp90 de los mamíferos incluyen la hsp90 (hsp83) citosólica y las homólogas del retículo endoplasmático hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94 (Erp99) y gp97, véase por ejemplo, Gething et al., (1.992) Nature 355:33-45. Los miembros de la familia hsp70 incluyen la hsp70 (p72) y la hsp70 (p73) citosólica, la homóloga del retículo endoplasmático BiP (Grp78), y la homóloga mitocondrial hsp70 (Grp75). Los miembros de la familia hsp60 de los mamíferos sólo se han identificado en la mitocondria. La última familia de HSPs también se encuentra en procariotas que sólo contienen otras tres familias principales de HSPs, las familias GroEL, GroES, DnaJ y DnaK. Al igual que en los eucariotas, se piensa que las HSPs procarióticas también funcionan en el plegamiento de las cadenas polipeptídicas nacientes durante la síntesis de proteínas.

En las células eucariotas que tienen organelos membranosos intracelulares, una de las funciones de las HSPs es de acompañar los fragmentos antigénicos desde un compartimiento celular a otro y presentar los fragmentos de péptidos a las moléculas MHC para su presentación sobre la superficie celular al sistema inmune. En el caso de células enfermas, las HSPs también acompañan a fragmentos de péptidos asociados a un tumor o virales hasta la superficie celular, Li and Sirivastave (1.994) Behring Inst. Mitt, 94:37-47 y Suzue et al., (1.997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13146-51. La función de acompañamiento se lleva a cabo a través de la formación de complejos entre las HSPs y los fragmentos de péptidos antigénicos y entre las HSPs y los fragmentos de péptidos asociados al tumor o virales en una reacción dependiente del ATP. Las HSPs forman complejos o se unen con un amplio espectro de fragmentos de péptidos de una manera dependiente del ATP. Parece que los péptidos unidos son una mezcla aleatoria de fragmentos de péptidos. No se han determinado las mezclas y las naturalezas exactas de los fragmentos de péptidos. Se ha observado la asociación de las HSPs con diversos fragmentos de péptidos también en tejidos normales y no es un fenómeno específico de tumor, véase Srivastava (1.994) Experimentia 50: 1054-60.

En un contexto terapéutico, se ha propuesto utilizar las HSPs de mamíferos como vacunas. WO 97/10000 y WO 97/10001 describen que una mezcla de HSPs aislada de células cancerígenas o células infectadas por un virus son capaces de conseguir una inmunidad protectora o linfocitos T citotóxicos hacia el tumor análogo ó antígeno viral. Sin embargo, en contraposición, las HSPs aisladas de células normales son incapaces de conseguir tal inmunidad. En la actualidad se piensa que las HSPs no son inmunogénicas per se, pero pueden conseguir inmunidad debido a su asociación con los fragmentos de péptidos antigénicos específicos del virus o tumor que se generan durante el procesamiento de los antígenos. Concretamente, los fragmentos de péptidos asociados con las HSPs son inmunogénicos y son presentados a las células T. Las HSPs desprendidas de los fragmentos de péptidos asociados pierden su inmunogenicidad, véase Udono, H. and Srivastava, P. K., Journal of Experimental Medicine, 178, página 1391 ff, 1.993. Hasta la fecha, no se ha determinado la naturaleza de estos fragmentos de péptidos.

Actualmente se cree que la antigenicidad de las SPs no es el resultado de las SP per se, sino del complejo de fragmentos de péptidos asociados con la SP. Esta conclusión se basa en una serie de características de los complejos. No existen diferencias en la estructura de las SPs derivadas de las células normales y tumorales. Determinados complejos pierden su inmunogenicidad tras el tratamiento con ATP, Udono et al., (1.993) J. Exp. Med. 178:1391-96. Tal pérdida de la inmunogenicidad es debida a la disociación del complejo en sus componentes SP y fragmento del péptido. La inmunogenicidad de las preparaciones de SP depende de la presencia de células fagocíticas, como los macrófagos y otras APCs. En la actualidad se piensa que las SPs son captadas por los macrófagos. A continuación, aquellos fragmentos de péptidos asociados con las SPs son presentados por las moléculas MHC tipo I del macrófago. De esta manera, se inicia la respuesta de las células T.

En WO 95/24923El se ha descrito el uso de complejos HSP de mamíferos de células infectadas como vacunas contra patógenos intracelulares. Se han propuesto las HSPs aisladas de células infectadas por virus como fuente de péptidos antigénicos, que podrían ser presentadas a continuación a las células T. Esto necesita la producción y purificación de las HSPs de tales células. El uso de proteínas HSP como componentes de vacunas se ha descrito adicionalmente en WO 97/10000, WO 97/10001 y WO 97/100002. Estos describen que una mezcla de HSPs aislada de células cancerosas o de células infectadas por virus pueden conseguir una inmunidad protectora o linfocitos T citotóxicos hacia el tumor análogo ó antígeno viral. Además WO 98/34641 describe que inesperadamente se requieren pequeñas cantidades de HSPs para inmunizar a los animales contra antígenos virales o tumores.

Todos estos métodos de vacunas HSP utilizan HSPs de mamíferos de las especies a inmunizar para la vacunación de las especies de animales deseadas.

Las propias HSPs de patógenos extracelulares también se han utilizado para inmunizar especies de mamíferos como antígenos per se pero no como portadores de fragmentos de péptidos antigénicos excepto como conjugados o proteínas de fusión híbridas. De esta manera WO 95/14093 describe que el uso de HspA y B de Helicobacter pylori como inmunógenos provoca una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esta respuesta resulta efectiva contra el organismo. De manera similar, WO 96/40928 describe que el uso de HSP 70 y 72 de Streptococcus provoca una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esta respuesta resulta efectiva contra el organismo. Además WO 90/02564 describe que el uso de HSPs de tripanosomales, micoplasmales o micobacteriales, y especialmente la HSP70, como inmunógenos provocan una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esto debería resultar efectivo contra los organismos respectivos. De manera alternativa US 5830475 utiliza las proteínas expresadas como fusiones de los genes HSP de M. bovis como antígenos y US 5736164 utiliza el epítopo de células T de hsp65 conjugado con antígenos pobremente...

1. Método para producir una composición de vacuna que comprende un determinante inmunogénico, que comprende las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el estímulo inductor de estrés es el calor.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el organismo patógeno se calienta de 5ºC a 8ºC por encima de la temperatura normal de cultivo del organismo.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organismo patógeno es un organismo patógeno bacteriano.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organismo patógeno se ha modificado genéticamente para inducir o potenciar la inducción de la síntesis de proteínas del estrés.

6. Uso de una composición de vacuna producida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición de vacuna para provocar una respuesta inmune en un animal contra el organismo patógeno a partir del cual se deriva el complejo proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico, que es el determinante inmunogénico de la composición de vacuna.