Método de purificación de complejos de proteínas de choque térmico.

Un método para la purificación, a partir de una mezcla de origen,

de al menos un complejo de proteínas de choque térmico formado por una proteína de choque térmico complejada con un fragmento de péptido, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) proporcionar una mezcla de origen que comprende al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana;

(ii) determinar el punto isoeléctrico (pI) de dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana que se va a purificar de la mezcla de origen;

(iii) preparar un lisado de células aclarado a partir de la mezcla de origen que comprende dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana;

(iv) someter el lisado de células a una purificación empleando una fase sólida de intercambio iónico, en el que el lisado de células se tampona empleando un tampón hasta un pH a una distancia de 2 unidades del pI de dicho complejo de proteínas de choque térmico diana, y en el que se emplea un gradiente salino para eluir dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana de la fase sólida de intercambio iónico;

(v) identificar una fracción eluida que contiene dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana basándose en el pI.

Método de purificación de complejos de proteínas de choque térmico Campo de la invención La presente invención se refiere a una nueva metodología para la purificación de complejos de proteínas que comprenden proteínas de choque térmico acopladas con fragmentos de péptidos. Los complejos de proteínas proporcionados pueden emplearse para la preparación de composiciones de vacuna para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y del cáncer.

Antecedentes de la invención La vacunación está ampliamente aceptada como el enfoque preferido para abordar la carga sanitaria global de enfermedades infecciosas y cánceres. Sin embargo, a pesar de los avances significativos en la comprensión de la biología molecular relacionada con las enfermedades infecciosas y los cánceres, el desarrollo de vacunas eficaces en estas áreas se ha visto limitado. Las vacunas más eficaces desarrolladas han empleado organismos vivos atenuados, pero el riesgo para la seguridad asociado que supone que estos patógenos atenuados reviertan a la virulencia ha limitado su uso amplio. Otro obstáculo importante que evita el desarrollo y uso a gran escala de vacunas más eficaces es la limitación asociada con la capacidad para identificar proteínas derivadas de patógenos candidatas que induzcan una inmunidad protectora amplia de una manera específica contra cepas variantes de patógenos microbianos cuando se administran como parte de una composición de vacuna.

Un enfoque concreto que promete conferir una inmunidad protectora amplia es el uso de complejos de proteínas de estrés como vacunas contra enfermedades infecciosas y cánceres (Colaco et al. (2004) , Biochem. Soc. Trans., 32:626-628; y Zeng et al. (2006) , Cancer Immunol. Immunother., 55:329-338) . También existe amplia documentación que indica que los complejos de proteínas de choque térmico/péptidos antigénicos son eficaces como vacunas contra cánceres específicos (patente de EEUU n.º 5.997.873; patente de EEUU n.º 5.935.576; patente de EEUU n.º 5.750.119; patente de EEUU n.º 5.961.979; y patente de EEUU n.º 5.837.251) . Colaco et al. han demostrado que los complejos de proteínas de choque-péptidos derivados de patógenos aislados a partir de células BCG sometidas a choque térmico inducen unas respuestas inmunológicas mediadas por T-auxiliares 1 (Th1) en un sujeto vacunado, que confieren inmunidad protectora contra una exposición viva en un modelo de exposición en aerosol murino de tuberculosis pulmonar (solicitud de patente internacional n.º WO 01/13944) . Además, se ha demostrado, en las solicitudes de patente internacional n.os WO 02/20045, WO 00/10597 y WO 01/13943, que los complejos de proteínas de estrés aislados a partir de patógenos o de células infectadas por patógenos son eficaces como determinante inmunogénico dentro de vacunas contra enfermedades infecciosas.

Las proteínas de choque térmico (hsp) forman una familia de proteínas altamente conservadas que están ampliamente distribuidas a través de los reinos vegetal y animal. Basándose en su peso molecular (kDa) , las principales proteínas de choque térmico se agrupan en seis familias diferentes: pequeñas (hsp de 20-30 kDa) ; hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; y hsp100. Aunque las proteínas de choque térmico fueron originariamente identificadas en células sometidas a estrés térmico, se ha descubierto que están asociadas con muchas otras formas de estrés, tales como infecciones, estrés osmótico, estrés de citoquinas y similares. Por consiguiente, las proteínas de choque térmico también se denominan habitualmente proteínas de estrés (SP) debido a que su expresión no es provocada solamente por un estrés térmico. Los miembros de la familia hsp60 incluyen la importante chaperona GroEL. Esta forma complejos multiméricos con cochaperonas, tales como GroES. Muchos patógenos microbianos presentan otras familias de hsp60 que forman complejos diferenciados a partir de GroEL, y algunos miembros de la familia de hsp60 pueden ser más inmunogénicos, tales como la hsp65 de micobacterias. Los miembros de la familia hsp70 incluyen DnaK, y estos miembros de la familia hsp70 también forman complejos multiméricos con cochaperonas, tales como DnaJ. Otras proteínas de choque térmico importantes incluyen las AAA ATPasas, las proteínas Clp, el factor de activación, Hip, HtpG, NAC, Clp, GrpE, SecB y prefoldina.

Las proteínas de estrés se expresan de forma ubicua en células procariotas y eucariotas, en donde actúan como chaperonas en el plegamiento y desplegamiento de polipéptidos. Otro papel que desempeñan las proteínas de estrés es acompañar como chaperona a péptidos desde un compartimento celular a otro y, en el caso de células enfermas, también se sabe que las proteínas acompañan como chaperona a los péptidos virales o asociados a un tumor hasta la superficie celular. La función de chaperona de las proteínas de estrés se realiza mediante la formación de complejos entre las proteínas de estrés y el polipéptido acompañado. Estos polipéptidos pueden incluir fragmentos de péptidos.

En la respuesta inmunológica, los polipéptidos heterólogos o fragmentos de polipéptidos complejados con las proteínas de estrés forman complejos de proteínas de estrés-péptidos que pueden denominarse complejos de proteínas de choque térmico (HspC) , Los HspC son capturados por células presentadoras de antígenos (APC) para proporcionar una fuente de péptidos antigénicos que pueden cargarse sobre moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) para la presentación sobre la superficie celular a las células T del sistema inmunológico.

Los HspC se han estudiado a fondo como vacunas del cáncer y se han desarrollado métodos para el aislamiento de

HspC de células tumorales para su uso como vacunas eficaces (patente de EEUU n.º 5.997.873; patente de EEUU n.º 5.935.576; patente de EEUU n.º 5.750.119; patente de EEUU n.º 5.961.979; y patente de EEUU n.º 5.837.251) . Sin embargo, estos métodos consiguen al aislamiento de familias limitadas, y por tanto se excluye específicamente el uso de múltiples proteínas de chaperonas como determinante inmunogénico en vacunas. El empleo de HspC como vacuna para el cáncer puede mejorar significativamente con el uso de múltiples proteínas de chaperonas, en particular proteínas de choque térmico (indicado en Zeng et al., Cancer Immunol. Immunother. (2006) , 55:329-338) y, así, se han desarrollado métodos para la purificación de múltiples proteínas de chaperonas y complejos de proteínas de chaperonas para su uso en vacunas. Por ejemplo, la patente de EEUU n.º 6.875.849 describe el uso del enfoque isoeléctrico de disolución libre (FF-IEF) para la purificación de HspC a partir de tumores para su uso como vacuna del cáncer.

Los presentes inventores han descubierto previamente que el FF-IEF también puede emplearse para aislar HspC a partir de patógenos y células infectadas para su uso como determinante inmunogénico en composiciones de vacunas para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, una limitación clave de esta técnica han sido las dificultades asociadas con el desarrollo de un instrumento de FF-IEF a gran escala para producir las cantidades de complejos de proteínas de choque térmico/péptidos (HspC) que serían necesarias para la fabricación de vacunas de GMP comerciales a gran escala. Además, el FF-IEF separa los complejos basándose en sus puntos isoeléctricos (pI) , y el proceso de enfoque de flujo libre es lento, con un tiempo de ejecución típico de 4 horas, durante las cuales se produce un alto nivel de degradación de las proteínas, limitando gravemente el uso del FF-IEF para la producción a gran escala de complejos de proteínas de choque térmico-péptidos purificados. Además, el uso de caotropos, tales como urea, para mantener la solubilidad de las proteínas durante la purificación puede conducir a la alteración de algunos complejos de proteínas de choque térmico-péptidos. Además, el uso de anfolitos (anfolinas) para producir el gradiente de pH necesario durante el proceso de FF-IEF resulta en la introducción de otro contaminante, además de los caotropos, en las preparaciones que contienen proteínas de choque térmico-péptidos. Estos contaminantes, que en sí mismos son inmunogénicos y también son inaceptables para las autoridades reguladoras, suponen una barrera significativa al uso del FF-IEF para la fabricación de composiciones de vacunas que contienen complejos de proteínas de choque térmico-péptidos.

El documento WO 02/28407 describe un método para purificar complejos de proteínas de choque térmico que emplea una cromatografía de afinidad de heparina.

Sumario de la invención La invención es un método para la purificación... [Seguir leyendo]

1. Un método para la purificación, a partir de una mezcla de origen, de al menos un complejo de proteínas de choque térmico formado por una proteína de choque térmico complejada con un fragmento de péptido, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) proporcionar una mezcla de origen que comprende al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana;

(ii) determinar el punto isoeléctrico (pI) de dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana que se va a purificar de la mezcla de origen;

(iii) preparar un lisado de células aclarado a partir de la mezcla de origen que comprende dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana;

(iv) someter el lisado de células a una purificación empleando una fase sólida de intercambio iónico, en el que el lisado de células se tampona empleando un tampón hasta un pH a una distancia de 2 unidades del pI de dicho complejo de proteínas de choque térmico diana, y en el que se emplea un gradiente salino para eluir dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana de la fase sólida de intercambio iónico;

(v) identificar una fracción eluida que contiene dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana basándose en el pI.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el tampón no incluye un caotropo.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tampón no incluye un anfolito.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón no incluye un tensioactivo.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gradiente salino es proporcionado por un tampón de elución que comprende cloruro de sodio.

6. El método según la reivindicación 5, en el que el pH del tampón de elución es de 3 a 10.

7. El método según la reivindicación 5, en el que el cloruro de sodio se proporciona dentro del tampón de elución a una concentración de 50 mM a 500 mM, y en el que el pH del tampón de elución es 6, 8.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la intercambio iónico se selecciona del grupo que consiste en cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de modo mixto.

9. El método según la reivindicación 8, en el que la cromatografía de intercambio aniónico se realiza a un pH de 5, 0 a 9, 0 y a una conductividad de 0, 5 a 5 mS/cm.

10. El método según la reivindicación 8, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza a un pH de 4, 0 a 9, 0 y a una conductividad de 0, 5 a 15 mS/cm.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico diana procede del grupo que consiste en una célula cancerosa, una célula patógena, una célula infectada por un organismo patógeno, una célula que se ha sido genéticamente modificada para que exprese una proteína heteróloga que procede de una célula cancerosa, y una célula que se ha sido genéticamente modificada para que exprese una proteína heteróloga que procede de un patógeno que provoca una enfermedad infecciosa en un hospedante.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el fragmento de péptido procede de un organismo patógeno que provoca una enfermedad infecciosa en un hospedante infectado, en el que el organismo patógeno se selecciona del grupo que consiste en una célula procariota, un protozoo, un virus, un parásito y un hongo.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la expresión de la proteína de choque térmico de dicho al menos un complejo de proteínas de choque térmico no solamente es provocada por un estrés térmico y puede estar asociada con otras formas de estrés, que incluyen infecciones, estrés osmótico y estrés de citoquinas.