SELECCIÓN DE CÉLULAS HOSPEDADORAS QUE EXPRESAN PROTEÍNA A ALTOS NIVELES.

Selección de células hospedadoras que expresan proteína a altos niveles. Campo de la invención La invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a medios y procedimientos para mejorar la selección de células hospedadoras que expresan proteínas a altos niveles. Antecedentes de la invención Las proteínas pueden producirse en diversas células hospedadoras para un amplio intervalo de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como productos biofarmacéuticos. Se prefieren con este fin células hospedadoras eucarióticas, y particularmente de mamífero, para la expresión de muchas proteínas, por ejemplo, cuando dichas proteínas tienen ciertas modificaciones postraduccionales tales como glucosilación. Los procedimientos para dicha producción están bien establecidos y suponen generalmente la expresión en una célula hospedadora de un ácido nucleico (también designado como transgén) que codifica la proteína de interés. En general, se introduce el transgén junto con un marcador seleccionable en una célula precursora, se seleccionan las células para la expresión del gen marcador seleccionable, se identifican el uno o más clones que expresan la proteína de interés a altos niveles y se usan para la expresión de la proteína de interés. Un problema asociado a la expresión de transgenes es que es impredecible, partiendo de la alta probabilidad de que el transgén se vuelva inactivo debido al silenciamiento génico (McBurney y col., 2002), y por lo tanto tiene que ensayarse en muchos clones de células hospedadoras una alta expresión del transgén. Son conocidos procedimientos para seleccionar células hospedadoras recombinantes que expresan niveles relativamente altos de proteínas deseadas, y varios de dichos procedimientos se debaten en la introducción del documento WO 2006/048459. En ciertos procedimientos ventajosos de la técnica anterior, se han descrito vectores de expresión bicistrónicos para una creación rápida y eficaz de líneas celulares de mamífero estables que expresan proteína recombinante. Estos vectores contienen un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) entre la secuencia de codificación en dirección 5 de la proteína de interés y la secuencia de codificación en dirección 3 del marcador de selección (Rees y col., 1996). Dichos vectores están comercialmente disponibles, por ejemplo, los vectores pIRES1 de Clontech (CLONTECHniques, octubre de 1996). Usando dichos vectores para introducción en células hospedadoras, la selección de una expresión suficiente de la proteína marcadora en dirección 3 selecciona entonces automáticamente altos niveles de transcripción del ARNm multicistrónico, y por tanto se prevé una probabilidad fuertemente aumentada de alta expresión de la proteína de interés usando dichos vectores. Preferiblemente en dichos procedimientos, el IRES usado es un IRES que da un nivel relativamente bajo de traducción del gen marcador de selección, para mejorar adicionalmente la oportunidad de seleccionar células hospedadoras con un alto nivel de expresión de la proteína de interés seleccionando la expresión de la proteína marcadora de selección (véanse, por ejemplo, los documentos WO 03/106684 y WO 2006/005718). La presente invención se dirige a proporcionar medios y procedimientos mejorados para la selección de células hospedadoras que expresan altos niveles de proteínas de interés. Sumario de la invención ES 2 367 530 T3 El documento WO 2006/048459 se presentó antes, pero se publicó después, de la fecha de prioridad de la presente solicitud. El documento WO 2006/048459 da a conocer un concepto para la selección de células hospedadoras que expresan altos niveles de polipéptidos de interés, designándose el concepto en la misma como traducción interdependiente recíproca. En ese concepto, se usa una unidad de transcripción multicistrónica en la que una secuencia que codifica un polipéptido marcador seleccionable está en dirección 5 de una secuencia que codifica un polipéptido de interés, y en la que la traducción del polipéptido marcador seleccionable está dañada por mutaciones en la misma, mientras que la traducción del polipéptido de interés es muy alta (véase, por ejemplo, la FIG. 13 de la misma para una visión esquemática). La presente invención proporciona medios y procedimientos alternativos para seleccionar células hospedadoras que expresan altos niveles de polipéptido. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptido de interés y ii) un polipéptido marcador seleccionable funcional en una célula hospedadora eucariótica, en la que el polipéptido de interés tiene una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido marcador seleccionable, y en la que la secuencia de codificación del polipéptido de interés está en dirección 5 de la secuencia de codificación del polipéptido marcador seleccionable en dicha unidad 2 de transcripción multicistrónica, y en la que está presente un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) en dirección 3 a la secuencia de codificación del polipéptido de interés y en dirección 5 de la secuencia de codificación del polipéptido marcador seleccionable, y en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido marcador seleccionable en la hebra de codificación comprende una secuencia de inicio de la traducción elegida del grupo constituido por: a) un codón de inicio GTG; b) un codón de inicio TTG; c) un codón de inicio CTG; d) un codón de inicio ATT y e) un codón de inicio ACG. La secuencia de inicio de la traducción en la hebra de codificación del polipéptido marcador seleccionable comprende un codón de inicio diferente del codón de inicio ATG, tal como una de las secuencias GTG, TTG, CTG, ATT o ACG, siendo los dos primeros de estas las más preferidas. Dichos codones de inicio no ATG están flanqueados preferiblemente por secuencias que proporcionan un reconocimiento relativamente bueno de las secuencias no ATG como codones de inicio, tales como al menos la traducción de inicio de algunos ribosomas a partir de estos codones de inicio, concretamente, la secuencia de inicio de la traducción comprende preferiblemente la secuencia ACC[codón de inicio no ATG]G o GCC[codón de inicio no ATG]G. En realizaciones preferidas, la proteína marcadora seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos letales y/o inhibidores del crecimiento de un agente de selección tal como un antibiótico. La invención proporciona adicionalmente módulos de expresión que comprenden una molécula de ADN según la invención, comprendiendo dichos módulos de expresión adicionalmente un promotor en dirección 5 de la unidad de expresión multicistrónica, y siendo funcionales en una célula hospedadora eucariótica para la iniciación de la transcripción de la unidad de expresión multicistrónica, y comprendiendo adicionalmente dichos módulos de expresión una secuencia de terminación de la transcripción en dirección 3 de la unidad de expresión multicistrónica. En realizaciones preferidas de los mismos, dichos módulos de expresión comprenden adicionalmente al menos un elemento de control de cromatina elegido del grupo constituido por una región de unión a matriz o armazón (MAR/SAR), una secuencia aislante, un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) y una secuencia antirrepresora. Se prefieren en este aspecto secuencias antirrepresoras, y en ciertas realizaciones se eligen dichas secuencias antirrepresoras del grupo constituido por: a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en las que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora; c) secuencias que son al menos un 70% idénticas en la secuencia nucleotídica a a) o a b), en las que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora y d) el complemento de una cualquiera de a) a c). La invención proporciona también células hospedadoras que comprenden moléculas de ADN según la invención. La invención proporciona adicionalmente procedimientos para generar células hospedadoras que expresan un polipéptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de: introducir en una pluralidad de células hospedadoras precursoras una molécula de ADN o un módulo de expresión según la invención, cultivar las células en condiciones de selección de la expresión del polipéptido marcador seleccionable y seleccionar al menos una célula hospedadora productora del polipéptido de interés. En un aspecto adicional, la invención proporciona procedimientos para la producción de un polipéptido de interés, comprendiendo los procedimientos cultivar una célula hospedadora,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN que comprende: una unidad de transcripción multicistrónica que comprende al menos una secuencia de codificación que codifica tanto i) un polipéptido de interés, como ES 2 367 530 T3 ii) un polipéptido marcador seleccionable funcional en una célula hospedadora eucariótica, en la que el polipéptido de interés tiene una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido marcador seleccionable, en la que al menos una secuencia de codificación del polipéptido de interés está en dirección 5 de al menos una secuencia de codificación del polipéptido marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, en la que está presente un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) en dirección 3 a al menos una secuencia de codificación del polipéptido de interés y en dirección 5 a al menos una secuencia de codificación del polipéptido marcador seleccionable, y caracterizada por que la secuencia de codificación que codifica el polipéptido marcador seleccionable comprende una secuencia de inicio de la traducción seleccionada del grupo constituido por: a) un codón de inicio GTG; b) un codón de inicio TTG; c) un codón de inicio CTG; d) un codón de inicio ATT y e) un codón de inicio ACG. 2. Una molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia de inicio de la traducción para el polipéptido marcador seleccionable comprende un codón de inicio GTG o un codón de inicio TTG. 3. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polipéptido marcador seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección. 4. Una molécula de ADN según la reivindicación 3, en la que dicho agente de selección se selecciona del grupo constituido por zeocina, puromicina, blasticidina, higromicina, neomicina, metotrexato, metionina sulfoximina y kanamicina. 5. Una molécula de ADN según la reivindicación 3, en la que el agente de selección es zeocina. 6. Una molécula de ADN según la reivindicación 1 o 2, en la que el polipéptido marcador seleccionable es una enzima sintetizadora de 5,6,7,8-tetrahidrofolato (dhfrdhfr). 7. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la unidad de transcripción multicistrónica comprende adicionalmente una secuencia que codifica un segundo polipéptido marcador seleccionable funcional en la célula eucariótica, en la que dicha secuencia codifica un segundo polipéptido marcador seleccionable: a) tiene una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido de interés, b) está dispuesta en dirección 5 de dicha secuencia que codifica un polipéptido de interés, c) no tiene ninguna secuencia ATG en la hebra de codificación después del codón de inicio de dicho polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio del polipéptido de interés y d) tiene un codón de inicio GTG o un codón de inicio TTG. 8. Un módulo de expresión que comprende una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho módulo de expresión un promotor en dirección 5 de dicha unidad de transcripción multicistrónica y una secuencia de terminación de la transcripción en dirección 3 de la unidad de transcripción multicistrónica, en el que dicho módulo de expresión es funcional en una célula hospedadora eucariótica para iniciar la transcripción de la unidad de transcripción multicistrónica. 9. Un módulo de expresión según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente al menos un elemento de control de cromatina seleccionado del grupo constituido por una región de unión a matriz o armazón (MAR/SAR), una secuencia aislante, un elemento de apertura de cromatina universal (UCOE) y una secuencia antirrepresora (STAR). ES 2 367 530 T3 10. Un módulo de expresión según la reivindicación 9, en el que dicho al menos un elemento de control de cromatina es una secuencia antirrepresora seleccionada del grupo constituido por: a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en los que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora; c) secuencias que son al menos un 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o a b), en las que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora; y d) el complemento de uno cualquiera de a) a c). 11. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o un módulo de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, siendo preferiblemente la célula hospedadora una célula de mamífero, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO). 12. Un procedimiento de generación de una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) introducir en una pluralidad de células precursoras una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o un módulo de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 y b) cultivar la pluralidad de células precursoras en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y c) seleccionar al menos una célula hospedadora que expresa el polipéptido de interés. 13. Un procedimiento de expresión de un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un módulo de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 y que expresa el polipéptido de interés a partir del módulo de expresión. 14. Un procedimiento según la reivindicación 13, que comprende adicionalmente recoger el polipéptido de interés. 15. Un procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dichas células hospedadoras son células CHO que tienen fenotipo dhfr - y en el que el módulo de expresión comprende una secuencia de codificación de un polipéptido marcador seleccionable que es una enzima sintetizadora de 5,6,7,8-tetrahidrofolato (dhfrdhfr), en el que dichas células se cultivan en un medio de cultivo que contiene folato y estando dicho medio de cultivo esencialmente desprovisto de hipoxantina y timidina. 21 ES 2 367 530 T3 22 ES 2 367 530 T3 23 ES 2 367 530 T3 24 ES 2 367 530 T3 ES 2 367 530 T3 26 ES 2 367 530 T3 27 ES 2 367 530 T3 28