Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles.

Una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptidomarcador seleccionable capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota,

y ii) un polipéptido deinterés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptidomarcador seleccionable,

en la que

la secuencia codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3' de la secuencia codificante parael marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, y

la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia ATG en lahebra codificante tras el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio delpolipéptido de interés, y en la que la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para elpolipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en lasposiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en laque el A del codón de inicio ATG es nt +1);

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

f) un codón de inicio ACG

.

Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles La invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a medios y métodos para mejorar la selección de células hospedantes que expresan proteínas a altos niveles.

Las proteínas pueden producirse en diversas células hospedantes para un amplio intervalo de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como productos biofarmacéuticos. Se prefieren para este fin células hospedantes eucariotas, y particularmente de mamífero, para la expresión de muchas proteínas, por ejemplo cuando dichas proteínas tienen ciertas modificaciones postraduccionales tales como glucosilación. Los métodos para dicha producción están bien establecidos, y suponen generalmente la expresión en una célula hospedante de un ácido nucleico (también denominado como “transgén”) que codifica la proteína de interés. En general, el transgén, junto con un gen marcador seleccionable, se introduce en una célula precursora, se seleccionan células para la expresión del gen marcador seleccionable, y se identifican uno o más clones que expresan la proteína de interés a altos niveles, y se usan para la expresión de la proteína de interés.

Un problema asociado a la expresión de transgenes es que es impredecible, partiendo de la alta probabilidad de que el transgén se haga inactivo debido al silenciamiento génico (McBurney et al., 2002) , y por lo tanto muchos clones de células hospedantes tiene que ensayarse en busca de la expresión elevada del transgén.

Se conocen métodos para seleccionar células hospedantes recombinantes que expresan niveles relativamente elevados de proteínas deseadas.

Un método describe el uso de proteínas marcadoras seleccionables con mutaciones en su secuencia codificante que disminuyen pero no destruyen la función del marcador (por ejemplo, documento WO 01/32901) . La razón fundamental es que se requieren mayores niveles de la expresión del marcador mutante cuando se emplean condiciones de selección y por lo tanto se logra la selección para la expresión elevada del marcador, seleccionando concomitantemente con eso células hospedantes que también expresan el gen de interés en niveles elevados.

Otro método hace uso de un gen marcador de selección bajo el control de una secuencia promotora que se ha mutado, de manera que el promotor tiene un nivel de actividad sustancialmente inferior a aquel de su tipo salvaje correspondiente (patente U.S. 5.627.033) .

Otro método describe el uso de una secuencia marcadora seleccionable dominante alterada, tal como neomicina fosfotransferasa con una secuencia Kozak de consenso alterada, para reducir el número de colonias a identificar e incrementar los niveles de expresión de un gen de interés que está coligado al marcador seleccionable dominante (patentes US 5.648.267 y 5.733.779) . En realizaciones preferidas allí, el gen de interés se coloca en un intrón (artificial) en el marcador seleccionable dominante. El gen de interés y el marcador seleccionable dominante están en casetes transcripcionales diferentes, y cada uno contiene su propio promotor eucariota en este método (patentes US 5.648.267 y 5.733.779) .

Otro método describe el uso de una unidad de transcripción monocistrónica que comprende un sitio de comienzo traduccional (Kozak) no óptimo unido a un marcador seleccionable para alterar la traducción del marcador seleccionable mediante el comienzo traduccional no óptimo para identificar secuencias génicas celulares que podrían superar tal alteración permitiendo la sobreproducción del marcador seleccionable (patente US 6.107.477) .

Otro método usa el principio de un gen marcador seleccionable que contienen un intrón que no se produce naturalmente en el gen seleccionable, en el que el intrón es capaz de ser empalmado en una célula hospedante para proporcionar ARNm que codifica una proteína seleccionable, y en el que el intrón en el gen seleccionable reduce el nivel de proteína seleccionable producida a partir del gen seleccionable en la célula hospedante (Patente Europea 0724639 B1) .

En todavía otro método, se usan constructos de ADN que comprenden un gen seleccionable situado en un intrón definido por un sitio dador de empalme 5’ que comprende una secuencia dadora de empalme eficiente de manera que la eficiencia de empalmar un ARNm que tiene dicho sitio dador de empalme está entre alrededor de 80-99%, y un sitio aceptor de empalme 3’, y un producto génico que codifica un producto de interés en dirección 3’ del sitio afector de empalme 3’, estando el gen seleccionable y el producto génico controlados por la misma región reguladora transcripcional (patente US 5.561.053) .

En ciertos métodos, se hace uso de constructos de vectores de expresión policistrónicos. Un documento previo del uso de este principio describe un vector de expresión policistrónico que contiene secuencias que codifican tanto la proteína deseada como una proteína seleccionable, secuencias codificantes las cuales están gobernadas por el mismo promotor y separadas por codones de señales de inicio y de parada traduccionales (patente US 4.965.196) . En realizaciones preferidas en el documento US 4.965.196, el marcador seleccionable es el gen DHFR amplificable. En una realización particularmente preferida del sistema descrito en el documento US 4.965.196, la secuencia que codifica el marcador seleccionable está en dirección 3’ de aquella que codifica el polipéptido deseado, de manera

que los procedimientos diseñados para seleccionar las células transformadas por el marcador seleccionable también seleccionarán la producción particularmente mejorada de la proteína deseada.

En mejoras adicionales basadas en el concepto de vectores de expresión multicistrónicos, se han descrito vectores bicistrónicos para la creación rápida y eficiente de estirpes celulares de mamíferos estables que expresan proteína recombinante. Estos vectores contienen un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) entre la secuencia codificante en dirección 5’ para la proteína de interés y la secuencia codificante en dirección 3’ del marcador de selección (Rees et al, 1996) . Tales vectores están comercialmente disponibles, por ejemplo el vector pIRES1 de Clontech (CLONTECHniques, octubre 1996) . Usando tales vectores para la introducción en células hospedantes, la selección de suficiente expresión de la proteína marcadora en dirección 3’ selecciona entonces automáticamente niveles de transcripción elevados del ARNm multicistrónico, y por tanto se prevé una probabilidad fuertemente incrementada de expresión elevada de la proteína de interés usando tales vectores.

Preferiblemente en tales métodos, el IRES usado es un IRES que da un nivel relativamente bajo de traducción del gen marcador de selección, para mejorar además las ocasiones de seleccionar células hospedantes con un nivel de expresión elevado de la proteína de interés seleccionando la expresión de la proteína marcadora de selección (véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 03/106684) .

La presente invención tiene como meta proporcionar medios y métodos mejorados para la selección de células hospedantes que expresan niveles elevados de proteínas de interés.

Sumario de la invención La presente invención usa un concepto nuevo y único para seleccionar células hospedantes que expresan niveles elevados de polipéptidos de interés, refiriéndose el concepto aquí como “reducción interdependiente recíproca”. Es único con respecto a los enfoques de la técnica anterior por cuanto se usa un nivel extra de regulación para ajustar finamente la cantidad de productos de traducción procedentes de un transcrito multicistrónico, con lo que se reduce el nivel de traducción de un polipéptido marcador seleccionable, incrementando de ese modo el nivel de traducción del polipéptido de interés codificado en la misma unidad de transcripción multicistrónica, es decir, el nivel de expresión del polipéptido de interés depende directamente y más o menos recíprocamente del nivel de expresión del polipéptido marcador seleccionable (véase la Fig. 13 para una vista esquemática) . Por el contrario, los enfoques que usan un IRES entre las secuencias codificantes para el polipéptido de interés y el polipéptido marcador seleccionable (por ejemplo Rees et al, 1996) implican la traducción independiente de ambos polipéptidos, de... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptido marcador seleccionable capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, y ii) un polipéptido de interés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido marcador seleccionable, en la que la secuencia codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3’ de la secuencia codificante para el marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, y la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia ATG en la hebra codificante tras el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio del polipéptido de interés, y en la que la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que el A del codón de inicio ATG es nt +1) ;

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y f) un codón de inicio ACG.

2. Una molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia de inicio de la traducción resultante en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable comprende un codón de inicio GTG o un codón de inicio TTG.

3. Una molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en la que cualquier secuencia ATG cuando está presente en el marco y que codifica metionina en la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable de tipo salvaje está mutada para codificar valina, treonina, isoleucina o leucina.

4. Una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido marcador seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección, por ejemplo un antibiótico.

5. Una molécula de ADN según la reivindicación 4, en la que dicho agente de selección se elige del grupo que consiste en: zeocina, puromicina, blasticidina, higromicina, neomicina, metotrexato, metionina sulfoximina y kanamicina.

6. Una molécula de ADN según la reivindicación 5, en la que el agente de selección es zeocina.

7. Una molécula de ADN según la reivindicación 5, en la que el polipéptido marcador seleccionable está codificado por el gen de resistencia a neomicina.

8. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido marcador seleccionable comprende además una mutación que reduce la actividad del polipéptido marcador seleccionable comparada con su contraparte de tipo salvaje, por ejemplo en la que el polipéptido marcador seleccionable es un polipéptido de resistencia a zeocina en el que la prolina en la posición 9 está cambiada por un aminoácido diferente.

9. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia codificante del polipéptido de interés comprende una secuencia de inicio de la traducción óptima.

10. Un casete de expresión que comprende una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además dicho casete de expresión un promotor en dirección 5’ de dicha unidad de expresión multicistrónica, y secuencias de terminación de la transcripción en dirección 3’ de la unidad de expresión multicistrónica.

11. Un casete de expresión según la reivindicación 10, que comprende además al menos un elemento de control de cromatina, escogido del grupo que consiste en una región de unión de matriz o armazón (MAR/SAR) , una secuencia aislante, un elemento de apertura de cromatina universal (UCOE) , y una secuencia antirrepresora (STAR) .

12. Un casete de expresión según la reivindicación 11, en el que dicho elemento de control de cromatina es una secuencia antirrepresora elegida del grupo que consiste en:

a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en el que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora;

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b) , en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora; y d) el complemento a una cualquiera de a) a c) .

13. Un casete de expresión según la reivindicación 12, en el que dicho casete de expresión comprende uno de: a) SEQ. ID. NO. 66, b) un fragmento de a) que tiene actividad antirrepresora; c) una secuencia que es al menos 70% idéntica en secuencia nucleotídica a a) o b) , en el que dicha

secuencia tiene actividad antirrepresora, en el que a) , b) o c) está situado en dirección 5’ del promotor que dirige la transcripción del gen multicistrónico.

14. Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que dicho gen multicistrónico está flanqueado en ambos lados por al menos una secuencia antirrepresora.

15. Un casete de expresión según la reivindicación 14, que comprende: 5’ -secuencia antirrepresora A - secuencia antirrepresora B - promotor - gen multicistrónico que codifica la proteína marcadora seleccionable funcional y, en dirección 3’ de ella, el polipéptido de interés - secuencia de terminación de la transcripción - secuencia antirrepresora C -3’,

en el que las secuencias antirrepresoras A y C pueden ser iguales o diferentes y se eligen del grupo que consiste en:

a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ED. NO. 65; b) fragmentos de una cualquiera de las secuencias de a) , teniendo dichos fragmentos actividad antirrepresora;

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b) , en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora, y en el que la secuencia antirrepresora B se elige del grupo que consiste en i) SEQ. ID. NO. 66, ii) un fragmento de i) que tiene actividad antirrepresora; y iii) una secuencia que es al menos 70% idéntica en secuencia nucleotídica a i) o ii) , en el que dicha secuencia tiene actividad antirrepresora.

16. Un casete de expresión según la reivindicación 15, en el que las secuencias antirrepresoras A y C se eligen de:

a) un cualquiera de SEQ. ID. NO. 7, SEQ. ID. NO. 9, SEQ. ID. NO. 17, SEQ. ID. NO. 27, SEQ. ID. NO. 29, SEQ. ID. NO. 43, SEQ. ID. NO. 44, SEQ. ID. NO. 45, SEQ. ID. NO. 47, o SEQ. ID. NO. 61; b) fragmentos de una de las secuencias de a) , teniendo dichos fragmentos actividad antirrepresora; y c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b) , en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora.

17. Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que el polipéptido de interés es una parte de una proteína multimérica.

18. Un casete de expresión según la reivindicación 17, en el que el polipéptido de interés es una cadena ligera de inmunoglobulina o una cadena pesada de inmunoglobulina.

19. Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, que comprende además:

a) una secuencia de pausa de la transcripción (TRAP) en dirección 5’ de dicho promotor y que está en una dirección 5’ a 3’; o b) una secuencia TRAP en dirección 3’ de dicha secuencia de terminación de la transcripción y que está en una orientación 3’ a 5’; o c) tanto a) como b) ;

en el que una secuencia TRAP es una secuencia que, cuando se coloca en una unidad de transcripción, da como resultado un nivel reducido de transcripción en el ácido nucleico presente en el lado 3’ de la TRAP, cuando se compara con el nivel de transcripción observado en el ácido nucleico en el lado 5’ de la TRAP, por ejemplo, en el que dicha TRAP es SEQ. ID. NO. 142.

20. Una molécula de ADN que comprende una secuencia que codifica un polipéptido marcador seleccionable funcional capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, caracterizada porque dicha molécula de ADN:

i) tiene una secuencia de inicio de la traducción elegida del grupo que consiste en: a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que el A del codón de inicio ATG es nt +1) ; b) un codón de inicio GTG; c) un codón de inicio TTG; d) un codón de inicio CTG; e) un codón de inicio ATT; y f) un codón de inicio ACG, seguido de una secuencia codificante marcadora seleccionable de otro modo funcional, y ii) porque la hebra codificante de la secuencia que define el polipéptido marcador seleccionable en dirección 3’ del codón de inicio no óptimo y hasta el codón de parada está desprovista de secuencias ATG.

21. Una célula hospedante que comprende una molécula de ADN o un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

22. Una célula hospedante según la reivindicación 21, que es una célula hospedante eucariota, preferiblemente una célula hospedante de mamífero.

23. Una célula hospedante según la reivindicación 22, que es una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

24. Un método para generar una célula hospedante que expresa un polipéptido de interés, comprendiendo el método las etapas de:

a) introducir en una pluralidad de células precursoras una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y b) cultivar las células generadas en condiciones que seleccionan la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y c) seleccionar al menos una célula hospedante que produce el polipéptido de interés.

25. Un método para producir un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula hospedante, comprendiendo dicha célula hospedante un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y expresar el polipéptido de interés a partir del casete de expresión.

26. Un método según la reivindicación 25, que comprende además aislar el polipéptido de interés.