FRAGMENTOS DE ADN QUE AUMENTAN LA EXPRESIÓN, USO DE LOS MISMOS Y PROCEDIMIENTOS PARA ENCONTRARLOS.

Fragmentos de ADN que aumentan la expresión, uso de los mismos y procedimientos para encontrarlos La invención hace referencia al campo de la biología molecular y la biotecnología. Más específicamente la presente invención hace referencia a medios y procedimientos para mejorar la expresión de ADN recombinante. Las proteínas pueden producirse en diversas células huésped para un amplio intervalo de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como productos biofarmacéuticos. Células huésped eucariotas y en particular células huésped de mamíferos se prefieren para este propósito para expresión de muchas proteínas, por ejemplo cuando tales proteínas tienen ciertas modificaciones postraduccionales tales como glucosilación. Los procedimientos para tal producción están bien establecidos y generalmente conllevan la expresión en una célula huésped de un ácido nucleico (también referido como transgén) que codifica la proteína de interés. En general, el transgén junto con un gen marcador seleccionable se introduce dentro de una célula precursora, las células se seleccionan por la expresión del gen marcador y se identifican uno o más clones que expresan la proteína de interés a niveles altos y se usan para la expresión de la proteína de interés. Se han descrito elementos de ADN que en general mejoran la expresión de ADN recombinante en células eucariotas. Ejemplos de tales elementos básicos son elementos anti-represores, tales como elementos STAR (documento WO 03/004704; Kwaks y cols., 2003), regiones de unión a matriz (MAR) (por ejemplo Phi-Van y cols., 1990; WO 02/074969, WO 2005/040377), elementos aislantes (por ejemplo West y cols., 2002; Chung y cols., 1993, 1997; Kellum y Schedl, 1991; WO 94/23046, WO 96/04390, WO 01/02553, WO 2004/027072), UCOE (documentos WO 00/05393, WO 02/24930, WO 02/099089, WO 02/099070). Estos elementos pueden al menos en parte funcionar contrarrestando los efectos represivos de la cromatina. Otro ejemplo de elementos que mejoran la expresión recombinante son los así llamados Elementos de Secuencia que Aumentan Expresión (EASE) como se describe en el documento EP 0873405 B1. Tales elementos se obtuvieron a partir de ADN genómico de las células de ovario de hámster chino (CHO). Varios de los elementos de ADN básicos que mejoran la expresión tienen una considerable longitud, siendo incluso más larga que 1 kb y a veces siendo de varias kb de longitud, lo que los hace en muchos casos menos fáciles de manipular y clonar en la configuración deseada en por ejemplo plásmidos de expresión. Además, diferentes tipos de elementos podrían actuar de forma diferente y así puede haber potencial para mejorar expresión recombinante interviniendo a diferentes niveles moleculares. Queda una necesidad en la técnica de incrementar expresión de ADN recombinante en células de mamíferos. La presente invención espera conseguir proporcionar medios y procedimientos para este propósito. Sumario de la invención Se reveló un concepto novedoso para seleccionar células huésped que expresen altos niveles de polipéptidos de interés en la solicitud internacional PCT/EP2005/055794 (publicada como documento WO 2006/048459), que se presentó antes pero se publicó después de la fecha de prioridad de la solicitud actual. Se reveló una alternativa en la solicitud de patente de EE.UU. n.º 11/359,953 (publicada como documento US 2006/0141577) y en la solicitud internacional PCT/EP2007/051696, también presentada antes pero publicada después de la fecha de prioridad de la solicitud actual. Las revelaciones de las solicitudes PCT/EP2005/055794, US 11/359,953 y PCT/EP2007/051696 se incorporan en su totalidad por referencia en el presente documento. Brevemente, aquellas solicitudes enseñan el uso de una secuencia que codifica un polipéptido marcador seleccionable con un codon de iniciación que no es ATG, por ejemplo un GTG o TTG. Esto dio como resultado la posibilidad de seleccionar clones con alta restrictividad y se usó para obtener clones de células huéspedes con niveles de expresión muy altos. La presente invención explota la restrictividad de selección obtenida por esas secuencias codificando un polipéptido marcador seleccionable con un codon de iniciación GTG o TTG, para una revisión novedosa capaz de obtener fragmentos de ADN que aumentan la expresión. Se han descrito procedimientos para revisar en busca de elementos anti-represores en la técnica anterior, por ejemplo en el documento WO 00/09749, pero en contraste con los presentes procedimientos tales procedimientos usaban ADN que codifica proteínas marcadoras seleccionables que tienen un codon de iniciación normal, es decir un codon de iniciación ATG. En un aspecto la presente invención proporciona un procedimiento de obtención de un fragmento de ADN que aumenta la expresión, procedimiento que comprende las etapas de: 1) proporcionar una diversidad de vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores fragmentos de ADN que tienen un tamaño de entre aproximadamente 50 y 5000 pares de bases, estando localizados dichos fragmentos a una distancia de menos de aproximadamente 5000 pares de bases de una unidad de transcripción, comprendiendo dicha unidad de transcripción un promotor unido operativamente a la secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege a una célula huésped de los efectos letales e inhibidores del crecimiento de un agente de selección, en el que la secuencia que codifica la proteína marcadora seleccionable tiene un codon de iniciación GTG o un codon de iniciación TTG; 2) introducir los fragmentos que comprenden vectores dentro de las células huésped; 3) cultivar 2 E07727141 25-11-2011   las células huésped en presencia del agente de selección; y 4) obtener el fragmento de ADN que aumenta la expresión a partir de las células huésped que aún pueden crecer en presencia del agente de selección después de al menos dos semanas. La invención proporciona adicionalmente una genoteca que comprende una diversidad de vectores que comprenden fragmentos, teniendo dichos vectores que comprenden fragmentos un tamaño de entre aproximadamente 50 y 5000 pares de bases, estando localizados dichos fragmentos a una distancia de menos de aproximadamente 5000 pares de bases de una unidad de transcripción, comprendiendo dicha unidad de transcripción un promotor unido operativamente a secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula huésped de los efectos letales e inhibidores de crecimiento de un agente de selección, en la que la secuencia que codifica la proteína marcadora seleccionable tiene un codon de iniciación GTG o un codon de iniciación TTG. En otro aspecto, la invención proporciona adicionalmente una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN que aumenta la expresión seleccionada del grupo constituido por: a) SEC. ID. N.º 3 (47D); b) SEC. ID. N.º 4 (44F); c) fragmentos de a) o b), en los que dicho fragmento tiene actividad que aumenta la expresión; y d) secuencias que son al menos idénticas al 70% en secuencia de nucleótidos a a), b) o c), en los que dichas secuencias tienen actividad que aumenta la expresión, dicha molécula de ADN recombinante comprende adicionalmente un casete de expresión, comprendiendo dicho casete de expresión un promotor heterólogo unido a un ácido nucleico de interés. La invención también proporciona una célula que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención. La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención para expresar el ácido nucleico que codifica la proteína de interés en dicha célula. Breve descripción de las figuras FIG. 1. Resultados con fragmentos de ADN que aumentan expresión (EADF) 44F y 47D en construcciones de expresión, en las células CHO-K1. La construcción de expresión de control no contiene secuencias EADF o STAR. Como otro control, se muestra la expresión de una construcción con STAR7 flanqueando la construcción y STAR67 anteriormente en la cadena con respecto al promotor. Véase ejemplo 1 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles de expresión promedio; las construcciones usadas están indicadas en el eje horizontal y representadas esquemáticamente por encima de la gráfica; el eje vertical indica señal de d2EGFP en clones resistentes a zeocina. FIG. 2. Como la Fig. 1, pero en las células CHO-DG44. Se usó el fragmento de ADN 47D que aumenta la expresión. Véase el ejemplo 1 para detalles. Descripción detallada de la invención El término "gen monocistrónico" se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica un polipéptido.... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN que aumenta la expresión seleccionado del grupo constituido por: a) SEQ ID NO 3; b) SEQ ID NO 4; c) fragmentos de a) o b), en los que dichos fragmento tienen actividad que aumenta la expresión; y d) secuencias que son al menos un 70% idénticas en secuencia de nucleótidos a a), b) o c), en las que dichas secuencias tienen actividad que aumenta la expresión; comprendiendo adicionalmente dicha molécula de ADN recombinante un casete de expresión, comprendiendo dicho casete de expresión un promotor heterólogo unido a un ácido nucleico de interés. 2. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico de interés codifica todo o parte de una proteína de interés. 3. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho fragmento de ADN que aumenta la expresión está situado anteriormente en la cadena con respecto a dicho promotor en dicho casete de expresión. 4. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho fragmento de ADN que aumenta la expresión y dicho promotor están separados por menos de 2 kb. 5. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho ácido nucleico de interés está presente en una unidad de transcripción multicistrónica que codifica adicionalmente una proteína marcadora seleccionable. 6. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la unidad de transcripción que codifica la proteína marcadora seleccionable en la hebra codificante comprende una secuencia de iniciación de traducción para la proteína marcadora seleccionable elegida del grupo constituido por: a) un codon de iniciación ATG en un contexto no óptimo para iniciación de traducción, que comprende la secuencia (C/T)(A/T/G)(A/T/G)ATG(A/T/C) en la que el codon de iniciación está subrayado; b) un codon de iniciación GTG; c) un codon de iniciación TTG; d) un codon de iniciación CTG; e) un codon de iniciación ATT; y f) un codon de iniciación ACG. 7. Una célula que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6. 8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, que es una célula de mamífero. 9. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que es una célula de CHO. 10. Un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-6 para expresar dicho ácido nucleico que codifica la proteína de interés en dicha célula. 11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende adicionalmente cosechar la proteína de interés. 12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que dicha célula es una célula de mamífero. 13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que dicha célula es una célula de CHO. 14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que dicha molécula de ADN recombinante está integrada en el genoma de dicha célula. 15. Un procedimiento de obtención de un fragmento de ADN que aumente la expresión comprendiendo el procedimiento las etapas de: 1) proporcionar una diversidad de vectores que comprenden fragmentos, teniendo dichos vectores que comprenden fragmentos un tamaño de entre aproximadamente 50 y 5000 pares de bases, estando localizados dichos fragmentos a una distancia de menos de aproximadamente 5000 pares de bases de una unidad de transcripción, comprendiendo dicha unidad de transcripción un promotor unido operativamente a secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula huésped de los efectos letales o 18 E07727141 25-11-2011   inhibidores de crecimiento de un agente de selección, en la que la secuencia que codifica la proteína marcadora seleccionable tiene un codon de iniciación GTG o un codon de iniciación TTG; 2) introducir los vectores que comprenden fragmentos desde la genoteca en las células huésped; 3) cultivar las células huésped en presencia del agente de selección; y 4) obtener el fragmento de ADN que aumenta la expresión a partir de células huésped que aún pueden crecer en presencia del agente de selección después de al menos dos semanas. 16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el agente de selección es zeocina. 17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el que la secuencia que codifica la proteína marcadora seleccionable tiene un codon de iniciación TTG. 18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la unidad de transcripción es una unidad de transcripción multicistrónica, que comprende la secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula huésped de los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección y una secuencia que codifica una proteína de la que se puede detectar la presencia. 19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la unidad de transcripción multicistrónica comprende en el siguiente orden: a) el promotor; b) la secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula huésped de los efectos letales o inhibidores de crecimiento de un agente de selección, en la que dicha secuencia está desprovista de secuencias ATG; y c) la secuencia que codifica una proteína de la que se puede detectar la presencia. 20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la unidad de transcripción multicistrónica comprende en el siguiente orden: a) el promotor; b) la secuencia que codifica una proteína de la que se puede detectar la presencia; y c) un sitio de entrada en ribosoma interno (IRES), unido operativamente a d) la secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula huésped de los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección. 21. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-20, en el que vectores que comprenden fragmentos se integran en el genoma de las células huésped. 22. Una genoteca que comprende una diversidad de vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores fragmentos de ADN que tienen un tamaño de entre aproximadamente 50 y 5000 pares de bases, estando localizados dichos fragmentos de ADN a una distancia de menos de aproximadamente 5000 pares de bases de una unidad de transcripción, comprendiendo dicha unidad de transcripción un promotor unido operativamente a secuencia que codifica una proteína marcadora seleccionable que protege una célula hospedadora de los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección, en la que la secuencia que codifica la proteína marcadora seleccionable tiene un codon de iniciación GTG o un codon de iniciación TTG. 19 E07727141 25-11-2011   FIG. 1 E07727141 25-11-2011   FIG. 2 21 E07727141 25-11-2011