SELECCIÓN DE CÉLULAS HUÉSPED QUE EXPRESAN PROTEÍNA EN ALTOS NIVELES.
Molécula de ADN que comprende una secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido marcador seleccionable que proporciona resistencia frente a zeocina o frente a neomicina,
caracterizada porque dicha molécula de ADN en la cadena codificante para el polipéptido marcador seleccionable tiene un codón de iniciación GTG o un codón de iniciación TTG, y porque se ha mutado la secuencia de marco de lectura abierto que codifica para la proteína marcadora seleccionable para sustituir al menos la mitad de sus dinucleótidos de CpG en comparación con la secuencia nativa de marco de lectura a b i e r t o q u e c o d i f i c a p a ra l a p r o t e í n a m a r c a d o r a seleccionable
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/053984.
Solicitante: CHROMAGENICS B.V..
Nacionalidad solicitante: Países Bajos.
Dirección: ARCHIMEDESWEG 4 2333 CN LEIDEN PAISES BAJOS.
Inventor/es: OTTE, ARIE, PIETER, KWAKS,THEODORUS,HENDRIKUS,JACOBUS, SEWALT,RICHARD GEORGE ANTONIUS BERNARDUS, VAN BLOKLAND,HENRICUS JOHANNES MARIA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 24 de Abril de 2007.
Clasificación PCT:
- C12N15/67 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Métodos generales para favorecer la expresión.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2356485_T3.pdf
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Fragmento de la descripción:
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención: La invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a medios y métodos para mejorar la selección de células huésped que expresan proteínas en altos niveles.
Las proteínas pueden producirse en diversas células huésped para una amplia gama de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como agentes biofarmacéuticos. Para este fin se prefieren células huésped eucariotas y particularmente de mamífero para la expresión de muchas proteínas, por ejemplo cuando tales proteínas tienen determinadas modificaciones postraduccionales tales como glicosilación. Los métodos para tal producción están bien establecidos, y generalmente implican la expresión en una célula huésped de un ácido nucleico (también denominado “transgén”) que codifica para la proteína de interés. En general, el transgén se introduce junto con un gen marcador seleccionable en una célula precursora, se seleccionan las células para determinar la expresión del gen marcador seleccionable, y se identifican uno o más clones que expresan la proteína de interés en altos niveles, y se usan para la expresión de la proteína de interés.
Se conocen métodos para seleccionar células huésped recombinantes que expresan niveles relativamente altos de proteínas deseadas (véanse, por ejemplo las introducciones en los documentos WO 2006/048459 y US 2006/0141577).
Un concepto novedoso para seleccionar células huésped que expresan altos niveles de polipéptidos de interés se dio a conocer en la solicitud internacional PCT/EP2005/055794 (publicada como el documento WO 2006/048459), que se presentó antes pero se publicó tras la fecha de prioridad de la presente solicitud. Se dio a conocer una alternativa en la solicitud de
patente estadounidense n.º 11/359.953 (publicada como el documento US 2006/0141577) y en la solicitud internacional PCT/EP2007/051696, presentada también antes pero publicada tras la fecha de prioridad de la presente solicitud. En resumen, estas solicitudes enseñan el uso de una secuencia que codifica para un polipéptido marcador seleccionable con un codón de iniciación distinto de ATG, por ejemplo un GTG o TTG. Esto dio como resultado la posibilidad de seleccionar clones con alta rigurosidad y se usó para obtener clones de células huésped con niveles de expresión muy altos.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar medios más mejorados y métodos para la selección de células huésped que expresan altos niveles de proteínas de interés.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los documentos PCT/EP2005/055794 (WO 2006/048459), US 11/359.953 (US 2006/0141577) y PCT/EP2007/051696 enseñan el uso de una secuencia que codifica para un polipéptido marcador seleccionable con un codón de iniciación distinto de ATG, por ejemplo un GTG o TTG. Esto dio como resultado la posibilidad de seleccionar clones con alta rigurosidad y se usó para obtener clones de células huésped con niveles de expresión muy altos.
La presente invención da a conocer genes marcadores seleccionables mejorados con un codón de iniciación GTG o TTG. Tales genes marcadores seleccionables mejorados pueden usarse por ejemplo en las unidades de transcripción y métodos de uso de las mismas descritos en los documentos WO 2006/048459 y US 2006/0141577. Esto conduce a (una selección de) células huésped más mejoradas con altos niveles de expresión.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido marcador seleccionable, comprendiendo dicha molécula de ADN en la cadena codificante una secuencia de inicio de la traducción para el polipéptido marcador seleccionable elegida del grupo que consiste en: a) un codón de iniciación GTG: y b) un codón de iniciación TTG; y en la que se ha mutado la secuencia de marco de lectura abierto que
codifica para la proteína marcadora seleccionable para sustituir al menos la mitad de sus dinucleótidos de CpG en comparación con la secuencia nativa de marco de lectura abierto que codifica para la proteína marcadora seleccionable.
Según la invención, la proteína marcadora seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos mortales y/o inhibitorios del crecimiento de un agente de selección, tal como un antibiótico. En particular, el polipéptido marcador seleccionable proporciona resistencia frente a zeocina o frente a neomicina.
La invención proporciona además una molécula de ADN según la invención, en la que la secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido marcador seleccionable es parte de una unidad de transcripción multicistrónica que comprende además una secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido de interés.
La invención proporciona además un casete de expresión que comprende tales moléculas de ADN, comprendiendo dicho casete de expresión un promotor en el sentido de 5' de dicha unidad de transcripción multicistrónica y preferiblemente una secuencia de terminación de la transcripción en el sentido de 3' de la unidad de transcripción multicistrónica.
La invención proporciona además células huésped que comprenden una molécula de ADN o un casete de expresión según la invención.
La invención proporciona además un método de expresión de un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula huésped que comprende el casete de expresión de la invención, y expresar el polipéptido de interés a partir del casete de expresión.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1. Resultados con un marcador de resistencia a zeocina con contenido de CpG reducido en células CHO-K1. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles de expresión promedio; el eje vertical indica señal de d2EGFP. Véase el ejemplo 1 para detalles.
Figura 2. Tal como en la figura 1, pero en este caso en células CHO-DG44. Véase el ejemplo 1 para detalles.
Figura 3. Resultados con marcador de resistencia a neomicina “pobre en CpG” que tiene diferentes mutaciones. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles de expresión promedio; el eje vertical indica señal de d2EGFP. Véase el ejemplo 2 para detalles.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y REALIZACIONES PREFERIDAS
La expresión “gen monocistrónico” se define como un gen que puede proporciona una molécula de ARN que codifica para un polipéptido. Una “unidad de transcripción multicistrónica”, también denominada gen multicistrónico, se define como un gen que puede proporcionar una molécula de ARN que codifica para al menos dos polipéptidos. La expresión “gen bicistrónico” se define como un gen que puede proporcionar una molécula de ARN que codifica para dos polipéptidos. Por tanto, un gen bicistrónico se encuentra abarcado dentro de la definición de un gen multicistrónico. Un “polipéptido” tal como se usa en el presente documento comprende al menos cinco aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y por ejemplo puede ser una proteína o una parte, tal como una subunidad, de la misma. Puede comprender modificaciones postraduccionales, por ejemplo glicosilación. En general, los términos polipéptido y proteína se usan de manera intercambiable en el presente documento. Un “gen” o una “unidad de transcripción” tal como se usa en la presente invención puede comprender ADN cromosómico, ADNc, ADN artificial, combinaciones de los mismos y similares. “Operativamente unido” se refiere a una situación en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma prevista. Por tanto, por ejemplo, un promotor “operativamente unido” a un cistrón está unido de tal manera que se consigue la expresión del cistrón en condiciones compatibles con el promotor. De manera similar, una secuencia de nucleótidos de un IRES operativamente unida a un cistrón está unida de tal manera que se consigue la traducción del cistrón en condiciones compatibles con el IRES.
Las moléculas de ADN de la invención pueden estar presentes en forma de ADN bicatenario,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1.
2.
3.
4.
5.
una secuencia de marco de
Molécula de ADN que comprende lectura abierto que codifica para un polipéptido marcador seleccionable que proporciona resistencia frente a zeocinao frente a neomicina, caracterizada porque dicha molécula de ADN en la cadena codificante para el polipéptido marcador seleccionable tiene un codón de iniciación GTG o un codón de iniciación TTG, y porque se ha mutado la secuencia de marco de lectura abierto que codifica para la proteína marcadora seleccionable para sustituir al menos la mitad de sus dinucleótidos de CpG en comparación con la secuencia nativa de marco de lectura abierto que codifica para la proteína marcadora seleccionable. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho codón de iniciación es TTG. Molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, que comprende una secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido que proporciona resistencia frente a zeocina, comprendiendo la molécula de ADN una secuencia elegida del grupo que consiste en: a) SEQ. ID. NO. 1, con la condición de que se ha
sustituido al menos la mitad de los dinucleótidos de CpG sin mutar la secuencia de aminoácidos que se codifica, y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG o bien TTG; y
b) SEQ. ID. NO. 1, en la que el nucleótido A en la posición 280 se sustituye por T, y con la condición que se ha sustituido al menos la mitad de los dinucleótidos de CpG sin mutar la secuencia de aminoácidos que se codifica, y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG
o bien TTG. Molécula de ADN según la reivindicación 3, que comprende SEQ. ID. NO. 3. Molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, que comprende una secuencia de marco de lectura abierto que
codifica para un polipéptido que proporciona resistencia frente a neomicina, comprendiendo la molécula de ADN una secuencia elegida del grupo que consiste en: a) SEQ. ID. NO. 5, con la condición de que se ha
sustituido al menos la mitad de los dinucleótidos de CpG sin mutar la secuencia de aminoácidos que se codifica, y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG o bien TTG; y
b) SEQ. ID. NO. 7, con la condición de que se ha sustituido al menos la mitad de los dinucleótidos de CpG de la cadena codificante sin mutar la secuencia de aminoácidos que se codifica, y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG
o bien TTG; y
c) SEQ. ID. NO. 5 o SEQ. ID. NO. 7, con la condición de que contiene una mutación que codifica para cualquiera de las siguientes variantes de polipéptido en comparación con el polipéptido codificado por las secuencias nativas:
(i) sustitución de valina en la posición 201 por glicina (201V>G), o
(ii) sustitución de ácido glutámico en la posición 185 por ácido aspártico (185E>D), o
(iii) una combinación de ambas mutaciones (i) y
(ii) (185E>D y 201V>G), con la condición adicional de que se ha sustituido al menos la mitad de los dinucleótidos de CpG de la cadena codificante sin mutación adicional de la secuencia de aminoácidos que se codifica más allá de la mutación indicada en (i)-(iii), y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG
o bien TTG.
6. Molécula de ADN según la reivindicación 5, que comprende SEQ. ID. NO. 9, con la condición de que el nucleótido A en la posición 555 se sustituye por C, y que el nucleótido T en la posición 602 se sustituye por G y que el nucleótido G
en la posición 603 se sustituye por T, y con la condición adicional de que el codón de iniciación es o bien GTG o bien TTG.
7. Molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido marcador seleccionable es parte de una unidad de transcripción multicistrónica que comprende además una secuencia de marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido de interés.
8. Molécula de ADN según la reivindicación 7, en la que el marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido marcador seleccionable está en el sentido de 5' del marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido de interés, y en la que el marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia de ATG en la cadena codificante.
9. Molécula de ADN según la reivindicación 7, en la que el marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido de interés está en el sentido de 5' del marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido marcador seleccionable, y en la que el marco de lectura abierto que codifica para el polipéptido marcador seleccionable está operativamente unido a un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
10. Casete de expresión que comprende la molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, comprendiendo dicho casete de expresión un promotor en el sentido de 5' de dicha unidad de expresión multicistrónica y una secuencia de terminación de la transcripción en el sentido de 3' de la unidad de expresión multicistrónica.
11. Casete de expresión según la reivindicación 10, que comprende además al menos un elemento de control de cromatina.
12. Célula huésped que comprende la molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o un casete de
expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10
11.
13. Método de generación de una célula huésped que puede expresar un polipéptido de interés, comprendiendo dicho 5 método las etapas de:
a) introducir en una pluralidad de células precursoras una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 o un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11,
10 b) cultivar la pluralidad de células precursoras en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y c) seleccionar al menos una célula huésped que expresa el polipéptido de interés.
15 14. Método de expresión de un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula huésped que comprende el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, y expresar el polipéptido de interés a partir del casete de expresión.
15. Método según la reivindicación 14, que comprende además recoger el polipéptido de interés.
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