Método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada,

que comprende las etapas de a) aplicar la muestra de sangre entera hemolizada, de la cual se sabe o se supone que contiene el analito de interés, a una columna rellena de material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, b) eluir el analito del RAM y c) detectar el analito, de modo que al menos en la etapa (a) se usa un tampón de pH superior a 8,0

La presente invención se refiere a un método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. El método comprende las etapas de introducción de una muestra de sangre entera hemolizada (de la cual se sabe o se supone que lleva un analito de interés) en una columna que contiene un material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, la elución del analito del RAM y la detección del analito, y al menos en su primera etapa se emplea un tampón de pH superior a 8,0. El nuevo método garantiza que la hemoglobina no interfiera en la detección del analito de interés y se puede emplear con facilidad para detectar en línea muchos analitos, p.ej. de una muestra de sangre entera hemolizada, como en la detección de un antibiótico, de folato o de fármacos inmunosupresores como tacrolimus o sirolimus.

Antecedentes de la presente invención

Cuanto más componentes hay en una muestra, más difícil resulta el análisis de un analito diana contenido en ella. Los eritrocitos contienen una cantidad impresionante de proteínas y componentes de bajo peso molecular que pueden interferir en la detección de un analito de interés en un fluido biológico como la sangre entera. Esta es una de las principales razones por la cual en los análisis clínicos rutinarios se usa con preferencia plasma sanguíneo, llamado simplemente plasma (es decir, una muestra de sangre entera anticoagulada, privada de células y eritrocitos) o suero sanguíneo, llamado simplemente suero (es decir, sangre entera coagulada, privada de células, eritrocitos y de la mayor parte de proteínas del sistema de coagulación, particularmente fibrina/fibrinógeno), respectivamente. Las muestras de sangre entera también resultan más difíciles de tratar, p.ej. en comparación con las de suero o plasma. La sangre entera tiende a ser menos estable y la ruptura lenta de los eritrocitos perjudica una medición fiable de muchos analitos interesantes.

Como se ha dicho arriba, el suero o el plasma se pueden obtener de la sangre entera y se pueden usar en la detección de un analito. En teoría las células y los eritrocitos también pueden eliminarse por filtración o centrifugación de la sangre entera. Sin embargo estos métodos no son apropiados para usar en un ajuste diagnóstico rutinario, ni permitirían la medición correcta de analitos presentes, al menos parcialmente, en el interior de los eritrocitos.

La gran mayoría de procedimientos conocidos del estado técnico para detectar un analito en una muestra de sangre entera requieren un tratamiento adicional de la muestra antes de poder cuantificar el analito. En muchos procedimientos el analito de interés se separa primero de la mayoría de sustancias potencialmente interferentes mediante métodos de precipitación o extracción selectiva. La extracción puede llevarse a cabo en fase líquida o sobre una fase sólida, lo cual se ejemplificará ilustrando algunos de los procedimientos utilizados para detectar determinados fármacos inmunosupresores o

folato, respectivamente.

Fármacos inmunosupresores bien conocidos son p.ej. micofenolato mofetil (MMF), rapamicina (RAPA, asimismo conocido como sirolimus) y tacrolimus (FK-506). El control terapéutico de los fármacos inmunosupresores es especialmente importante en los pacientes trasplantados y también en los pacientes de SIDA (véase p.ej.: Drug. Ther. Perspect. 17(22) (2001) 8-12). La mayoría de pacientes que reciben un trasplante de órganos sólidos necesitan terapia inmunosupresora de por vida para evitar el rechazo alogénico. No obstante, como muchos agentes inmunosupresores tienen unos márgenes terapéuticos estrechos y están relacionados con varias toxicidades e interacciones potenciales entre diferentes fármacos, el uso del control de fármacos terapéuticos (TDM) junto con la evaluación clínica de los pacientes puede ser de especial importancia.

El tacrolimus es un antibiótico macrólido que se aprobó primero por la “US Food and Drug Administration (FDA)” [Administración de alimentos y fármacos de EEUU] en 1994 para evitar el rechazo alogénico del trasplante de hígado. Es hasta 100 veces más potente que la ciclosporina in vitro y clínica-mente se relaciona con una mayor disminución de la incidencia del rechazo hístico. La eficacia del tacrolimus se ha demostrado tanto en terapia inmunosupresora primaria para pacientes sujetos a diversos procedimientos de trasplante, como en terapia de recuperación para pacientes con rechazo alogénico agudo y refractario tras un trasplante de hígado o de riñón. La concentración terapéutica mínima está comprendida en el intervalo de 5-20 µg/l.

Dado que al menos una parte del tacrolimus presente en

la circulación está distribuido en los eritrocitos, para el análisis clínico rutinario de este fármaco se usa una muestra de sangre entera. P.ej., el tacrolimus se puede detectar por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), por HPLC conectado a espectrometría de masas (MS), mediante un ensayo radiorreceptor (RRA) o un inmunoensayo (IA). Las dos últimas metodologías no detectan con la misma sensibilidad el tacrolimus ni algunos de sus metabolitos, lo cual puede interferir en el procedimiento utilizado (Murthy J. N., y otros, Clin. Biochem. 31 (1998) 613-617). El procedimiento HPLC-MS puede considerarse el método de referencia, al menos para detectar los distintos metabolitos del tacrolimus. Sin embargo todos los procedimientos arriba mencionados requieren la extracción del tacrolimus de la sangre entera. Normalmente en la rutina clínica para extraer el tacrolimus de la sangre entera se usa acetonitrilo y al parecer no existe ningún método para medir en línea el tacrolimus de una muestra de sangre entera. El sirolimus es un antibiótico macrólido como el tacrolimus. Fue aprobado por primera vez en 1999 por la FDA norteamericana para evitar el rechazo alogénico tras el trasplante de riñón y realmente ha dado resultados prometedores a este respecto, cuando se ha usado intensamente en combinación con ciclosporina y corticosteroides. In vitro, el sirolimus es hasta 100 veces más potente que la ciclosporina y clínicamente puede mostrar un sinergismo con ella, que quizás permita disminuir la dosificación de ciclosporina. La concentración terapéutica mínima está comprendida en el intervalo de 5-15 µg/l.

Al igual que el tacrolimus, hay una cantidad importante

de sirolimus en los eritrocitos. Por lo tanto es necesaria la extracción de una muestra de sangre entera, independientemente del método de detección. En la rutina clínica una muestra que contenga hipotéticamente sirolimus se somete a HPLC y el sirolimus se detecta por luz ultravioleta (UV) o por espectroscopia de masas tándem (MS/MS). Recientemente también se ha descrito un inmunoensayo enzimático por micropartículas (Jones K. y otros, Clinical Therapeutics 22, Suppl. B (2000) B49-B61).

Folato es el nombre genérico de un grupo de moléculas análogas que difieren en su estado de oxidación. Los folatos forman parte del grupo de las vitaminas hidrosolubles B y son importantes como coenzimas para el metabolismo de la homocisteína y para la transferencia de grupos monocarbonados que requiere la replicación de ADN. Un nivel inadecuado de folato está relacionado con un mayor riesgo de defectos del tubo neural y se asocia con enfermedad cardiovascular, anemia, con ciertos cánceres y con la enfermedad de Alzheimer. Las concentraciones de folato en suero o plasma reflejan la ingesta dietética reciente y las concentraciones de folato en eritrocitos indican más bien los trastornos corporales (Gunter E.W. y otros, Clin. Chem. 42 (1996) 1689-1694; Fazili Z. y otros, Clin. Chem. 51 (2005) 2318-2325; Pfeiffer C.M. y otros, Clin. Chem. 50 (2004) 423-432). El folato total en eritrocitos (el folato en glóbulos rojos = folato RBC) es la mejor medida del nivel total de folatos en el cuerpo. En estudios recientes se ha comprobado que el 5-metil-tetrahidrofolato es el vitámero

de folato predominante en los eritrocitos circulantes. Para

diagnosticar la falta de folato se recomienda efectuar las determinaciones no solo en suero o en plasma, sino también en eritrocitos, ya que más del 95% del folato está localizado en ellos. La concentración en los eritrocitos refleja de manera más fidedigna el nivel real de folato.

Se dispone de varios métodos para medir folato en diferentes matrices. Los métodos analíticos principales son los ensayos microbiológicos y radioinmunológicos y los métodos de quimioluminiscencia, cromatografía y espectrometría de...

1. Método para detectar un analito en una muestra de sangre entera hemolizada, que comprende las etapas de

a) aplicar la muestra de sangre entera hemolizada, de la cual se sabe o se supone que contiene el analito de interés, a una columna rellena de material cromatográfico de acceso restringido (RAM) al que se fija el analito, b) eluir el analito del RAM y c) detectar el analito,

de modo que al menos en la etapa (a) se usa un tampón de pH superior a 8,0.

2. El método de la reivindicación 1, en que el RAM se elige entre sílice porosa y partículas poliméricas porosas.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en que la superficie interna del RAM fija el analito de interés mediante interacción hidrófoba, iónica o polar.

4. El método según la reivindicación 3, en que los poros de la sílice porosa o de las partículas poliméricas porosas tienen una superficie interna hidrófoba y un recubrimiento exterior hidrófilo.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que la superficie interna del RAM fija el analito de interés por interacción hidrófoba.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que el tamaño de poro del RAM está comprendido entre 60 y 120 Å.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la fracción proteica comprende polipéptidos

de 15 kDa y más grandes.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que el analito se separa posteriormente por HPLC de fase inversa tras ser eluido de la columna RAM.

5 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en que el analito tiene un peso molecular de 10 kDa o menos.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en que el analito se selecciona del grupo constituido por fármacos inmunosupresores, estupefacientes, ácido fólico y vitámeros de ácido fólico.