RECEPTOR DE HEMATOPOYETINA Y SECUENCIAS GENETICAS QUE LO CODIFICAN.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UN NUEVO RECEPTOR DE LA HEMOPOYETINA,

O A COMPONENTES O PARTES DEL MISMO, Y A LAS SECUENCIAS GENETICAS QUE LO CODIFICAN. LAS MOLECULAS RECEPTORAS Y SUS COMPONENTES Y/O PARTES, Y LAS SECUENCIAS GENETICAS QUE LOS CODIFICAN SEGUN LA PRESENTE INVENCION SON UTILES PARA EL DESARROLLO DE UNA AMPLIA GAMA DE AGONISTAS, ANTAGONISTAS Y REACTIVOS TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS BASADOS EN LA INTERACCION DEL LIGANDO CON SU RECEPTOR

Receptor de hematopoyetina y secuencias genéticas que lo codifican.

La presente invención se relaciona de manera general con un receptor de hematopoyetina novedoso o componentes o partes del mismo como se define aquí y con secuencias genéticas que codifican el mismo. Las moléculas del receptor y sus componentes y/o partes y las secuencias genéticas que lo codifican de la presente invención son útiles en el desarrollo de un amplio rango de agonistas, antagonistas, reactivos terapéuticos y diagnósticos con base en la interacción del ligando con su receptor.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas numéricamente en esta especificación se agrupan al final de la descripción. Los números de identidad de secuencia (SEQ ID NOs.) para las secuencias de nucleótido y aminoácido referidas en la especificación se definen luego de la bibliografía.

A través de la especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto indique otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones tal como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un entero establecido o grupo de interés pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.

El receptor de hematopoyetina preferido de la presente invención se denomina aquí como "NR4". El receptor NR4 interactúa con IL-13 y se denomina aquí como el receptor IL-13 o más particularmente la cadena a del receptor IL-13 (IL-13Ra). Estos términos se utilizan intercambiablemente a lo largo de la especificación objeto. Las especies de las que un NR4 particular se deriva se dan en una abreviatura de única letra. Por ejemplo, murino es "M" y humano es "H", Una forma recombinante puede tener el prefijo "r".

La sofisticación rápidamente incrementada de técnicas de ADN recombinantes facilita grandemente la investigación en los campos de salud, médico y afines. La investigación de citoquina es de particular importancia, especialmente cómo estas moléculas regulan la proliferación, diferenciación y función de una amplia variedad de células. La administración de citoquinas recombinantes o la función de citoquina reguladora y/o síntesis llegan a ser crecientemente el foco de búsqueda médica en el tratamiento de un rango de afecciones de enfermedad.

A pesar del descubrimiento de un rango de citoquinas y otros reguladores secretados de la función celular, comparativamente pocas citoquinas se utilizan directamente o se objetivan en regímenes terapéuticos. Una razón, para esto es la naturaleza pleiotrópica de muchas citoquinas. Por ejemplo, interleuquina (IL)-11 es una molécula funcionalmente pleiotrópica (1,2), caracterizada inicialmente por su capacidad para estimular la proliferación de la estirpe celular de plasmacitoma dependiente de IL-6, T11 65 (3). Otras acciones biológicas de IL-11 incluyen la inducción de la proliferación celular progenitora de hemapoyetina multipotencial (4,5,6), el mejoramiento de la formación de plaqueta y de megacariocito (7,8,9,10), la estimulación de la síntesis de proteína de fase aguda (11) y la inhibición de la actividad de lipasa lipoproteína de adipocito (12, 13).

La interleuquina-13 (IL-13) es otra citoquina importante que comparte un número de características estructurales con interleuquina-4 (IL-4) [revisión en 14 y 15]. Los genes para IL-4 y IL-13 tienen una estructura de intrón/exón relacionada y se ubican cerca junto al cromosoma 5 en el humano y la región sinténica del cromosoma 11 en el ratón (14, 15). En el nivel de proteína, la IL-4 y IL-13 tiene aproximadamente 30% de identidad de aminoácido, que incluye cuatro residuos cisteína. Biológicamente, la IL-13 y IL-4 que son también similares, se producen por células T activadas y actúan, por ejemplo, macrófagos para inducir la diferenciación y suprime la producción de citoquinas inflamatorias. Adicionalmente, la IL-13 humano puede actuar como una señal coestimuladora para La proliferación de célula B y afectan el cambio de isotipo de inmunoglobulina (14, 15). La función pleiotrópica y diversa de IL-13 y otras citoquinas hemopoyéticas hace a este grupo importante para estudio, especialmente en el nivel de interacción de los citoquina con sus receptores. La manipulación y control de receptores de citoquina y de la interacción del receptor de citoquina es potencialmente muy importante en muchas situaciones terapéuticas, especialmente donde la citoquina objetivo es fun- cionalmente pleiotrópica y se desea bloquear ciertas funciones de una citoquina objetivo pero no todas las funciones.

La investigación de IL-13 y su receptor se ha visto obstaculizada debido a la incapacidad de clonar secuencias genéticas que codifican todo o parte del receptor IL-13. Zurawski et. al. (J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, No. 23, p13869-13878) describe la identificación de una proteína de unión primaria para IL-13 en números bajos en células hemopoyéticas. Obiri et al. (J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, No. 15, p8797-8804) también identifica una proteína de unión de IL-13 en una variedad de células. No se describen las secuencias de nucleótido que codifican estas o cualquier otra proteína de unión de IL-13. De acuerdo con la presente invención, las secuencias genéticas que ahora se han clonado codificando la cadena a del receptor IL-13, una subunidad del receptor que también comparte con el receptor IL-4. La disponibilidad de estas secuencias genéticas permite el desarrollo de un rango de agentes diagnósticos y terapéuticos capaz de modular o monitorear la actividad IL-13 así como también la actividad de citoquinas relacionadas con IL-13 en el nivel de estructura o función. De acuerdo con la presente invención, un ejemplo de una citoquina relacionada en estructura y función a IL-13 es IL-4.

Se describe aquí una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o com- plementan una secuencia que codifican un receptor de hematopoyetina de un animal o un hbox{derivado de dicho receptor.

Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementa una secuencia que codifica un receptor de hematopoyetina de animal o un derivado del mismo, se describe dicho receptor capaz de interacción con IL-13 o un derivado de IL-13.

En una realización relacionada, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifican un receptor de hematopoyetina animal o un derivado del mismo, en donde dicho receptor:

(i) es capaz de interacción con IL-13 o sus derivados; y

(ii) es capaz de interacción con un complejo entre IL-4 y se describe la cadena a del receptor IL-4.

De acuerdo con estas realizaciones, un derivado de IL-13 incluye agonistas, antagonistas, anticuerpos e imitadores.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifica una cadena a del receptor IL-13 de animal o un derivado del mismo.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifican un componente de un receptor IL-4 animal o un derivado del mismo.

Preferiblemente, el animal es un mamífero o una especie de ave. Particularmente, los animales preferidos incluyen humanos, animales de prueba de laboratorio (por ejemplo primates, ratones, conejos, hámsteres, conejillos de indias), animales de ganado (por ejemplo ovejas, cabras, caballos, cerdos, vacas, burros), animales de compañía (por ejemplo perros, gatos), animales silvestres en cautiverio (por ejemplo zorros, canguros, dingos) y aves de corral (por ejemplo pollos, gansos, patos) y aves de caza (por ejemplo emús, avestruces). Aunque la presente invención se ejemplifica con respecto a los ratones y humanos, el alcance de la invención objeto se extiende a todos los animales y aves.

De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácido

        (i)        como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido;...

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácido

        (i)        como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido; o

        (ii)        que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (i); o dicha secuencia de nucleótidos tienen una secuencia de nucleótido

        (iii)        como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una parte de la misma que comprende la secuencia de dicha secuencia de nucleótido que codifica la porción de unión de IL-13; o

        (iv)        que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia in (iii), o

        (v)        es capaz de hibridar a la secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una forma complementaria de la misma bajo condiciones altamente exigentes, utilizando de por lo menos 31% v/v a por lo menos 50% v/v de formamida y de por lo menos 0.01M a por lo menos 0.15M de sal para hibridación, y por lo menos 0.01M a por lo menos 0.15M para lavado, o

        (vi)        que es una secuencia complementaria de una secuencia de (iii) a (v), en donde dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicha secuencia de (v) comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70% de similitud con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que codifica un receptor de hematopoyetina capaz de interacción con IL-13, cuya interacción es capaz de inhibición competitiva mediante IL-4 en células que expresan una cadena a del receptor IL-4.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado está en la forma de una proteína de fusión.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado está en una forma soluble.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado es una cadena a del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

7. Una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ligada operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula anfitriona.

8. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en las secuencias (i) o (ii) en la reivindicación 1 o codificada por una secuencia de nucleótido como se define en las secuencias (iii) o (iv) en la reivindicación 1 o una secuencia complementaria de la misma, dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13.

9. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 se inhibe competitivamente mediante IL-4 en células que expresan una cadena a del receptor IL-4.

10. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 es con baja afinidad.

11. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 es con medio a alta afinidad.

12. Un polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en donde dicho polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons como se determina por Análisis Western blot cuando se expresa en células COS.

13. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicho polipéptido está en la forma de una proteína de fusión.

14. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en donde dicho polipéptido está en una forma soluble.

15. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en donde dicho polipéptido es una cadena a del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

16. Un anticuerpo específico al polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

17. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

18. Un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción con por lo menos dos citoquinas en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecidas en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de las mismas que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

19. Un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción de alta afinidad con por lo menos una citoquina en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

20. Un receptor híbrido de hemopoyetina de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 capaz de interacción con IL-4.

21. Un receptor híbrido de hemopoyetina de acuerdo con la reivindicación 19 capaz de interacción con una citoquina seleccionada de IL-2, IL-5, IL-7, IL-9 y IL-15.

22. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

23. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

24. Un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para uso como un medicamento.

25. Un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para tratar asma, alergia o una afección exacerbada por la producción de IgE.

26. Uso de un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en la preparación de un medicamento para tratar asma, alergia o una afección exacerbada por la producción de IgE.

27. Un método para producir un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, dicho método que comprende células de cultivo que comprende la construcción genética de acuerdo con la reivindicación 7 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para expresar la molécula de ácido nucleico en dicha construcción genética para producir un polipéptido recombinante y aislar dicho polipéptido recombinante.

28. Células de animal aisladas que comprenden la construcción genética de acuerdo con la reivindicación 7 y que expresan el polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 producido por el método de acuerdo con la reivindicación 27.

29. Una proteína de fusión que comprende una primera porción capaz de interacción con IL-13, en donde dicha primera porción se codifica por una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y una segunda porción derivada de un receptor de hematopoyetina, un receptor tirosina quinasa, un receptor TNF/NGF o una proteína G acoplada al receptor.

30. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 29 en donde la segunda porción comprende toda o una proteína funcional de La proteína de unión de IL-13, Cadena a del receptor IL-4, cadena ? del receptor IL-4 o un receptor para una citoquina implicada en asma o alergia.

31. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 16 o 17 para uso como un medicamento.

32. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 16 o 17 en donde dicho anticuerpo inhibe la interacción de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 con la cadena a del receptor IL-4.