Polipéptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2

Polipéptidos con actividad antimicrobiana y polinucleótidos que codifican los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad antimicrobiana y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes comprendiendo los polinucleótidos al igual que a métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Ovchinnikova et al. "Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina", FEBS Lett., vol. 577, págs. 209-214 (2004) divulgó dos péptidos antimicrobianos de 21 residuos, arenicina-1 y arenicina-2, exhibiendo actividad contra bacterias gram-positivas y gram-negativas y hongos de coelomocytes de poliquetos marinos Arenicola marina (lombriz). Arenicinas no tienen ninguna similitud de estructura ni homología secuencial a ningún péptido antimicrobiano identificado previamente.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos con actividad antimicrobiana y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados teniendo actividad antimicrobiana y teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana, y teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, y células huéspedes recombinantes comprendiendo los polinucleótidos.

La presente invención también se refiere a métodos para producir tales polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana comprendiendo (a) cultivar una célula huésped recombinante comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos y polinucleótidos de la invención.

Definiciones

Actividad antimicrobiana: el término "actividad antimicrobiana" se define aquí como una actividad que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de células microbianas. En el contexto de la presente invención el término "antimicrobiano" se destina a significar que hay un efecto bactericida y/o un efecto bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o virucida, donde el término "bactericida" ha de entenderse como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" ha de entenderse como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir inhibir el crecimiento de células bacterianas. El término "fungicida" ha de entenderse como capaz de matar células fúngicas. El término "fungistático" ha de entenderse como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir inhibir el crecimiento de células fúngicas. El término "virucida" ha de entenderse como capaz de inactivar el virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o células fúngicas (incluyendo levaduras).

En el contexto de la presente invención el término "inhibir el crecimiento de células microbianas" se destina a significar que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que no son capaces de propagarse.

Para objetivos de la presente invención, actividad antimicrobiana puede ser determinada según el procedimiento descrito por Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991). Alternativamente, la actividad antimicrobiana puede ser determinada según las directrices del NCCLS de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute; antiguamente conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Polipéptidos teniendo actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 24 horas (preferiblemente después de 12 horas, más preferiblemente después de 8 horas, más preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de un 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de un 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de un 5%(p/p); aún más preferiblemente en una solución acuosa de un 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa de un 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de un 0,1%(p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana.

Los polipéptidos con actividad antimicrobiana también puede ser capaz de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; aún más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después de 24 horas (preferiblemente después de 12 horas, más preferiblemente después de 8 horas, más preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20ºC en una solución acuosa de un 25%(p/p); preferiblemente en una solución acuosa de un 10%(p/p); más preferiblemente en una solución acuosa de un 5%(p/p); aún más preferiblemente en una solución acuosa de un 1%(p/p); de la forma más preferible en una solución acuosa de un 0,5%(p/p); y en particular en una solución acuosa de un 0,1%(p/p) de los polipéptidos con actividad antimicrobiana.

Polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden también ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25ºC en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm; preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm; más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm; aún más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm; de la forma más preferible cuando se añade en una concentración de 50 ppm; y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm.

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, aún más preferiblemente al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, aún más preferiblemente al menos un 100% de la actividad antimicrobiana del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" como se utiliza en este caso se refiere a un polipéptido que es al menos un 20% puro, preferiblemente al menos un 40% puro, más preferiblemente al menos un 60% puro, aún más preferiblemente al menos un 80% puro, de la forma más preferible al menos un 90% puro, y aún más preferiblemente al menos un 95% puro, según es determinado por SDS-PAGE.

Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" denota aquí una preparación de polipéptidos que contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, como mucho un 3%, aún más preferiblemente como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1%, y aún más preferible como mucho un 0,5% en peso de otro material polipéptido con el que se asocia de forma nativa. Es, por lo tanto, preferido que el polipéptido sustancialmente puro...

1. Polipéptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

7. Polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.

8. Polipéptido según la reivindicación 7, que consiste en la SEC ID NO:2.

9. Polipéptido según la reivindicación 7, que consiste en los aminoácidos 1 a 21 de la SEC ID NO:2.

10. Polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido de la reivindicación 10 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

12. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 11.

13. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 11.

14. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 comprendiendo (a) cultivar una célula que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, o cultivar una célula huésped comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

15. Composición comprendiendo un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Método in vitro para matar o inhibir el crecimiento de células microbianas, comprendiendo contactar las células microbianas con un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

17. Polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el uso como un medicamento.

18. Uso de un polipéptido antimicrobiano como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un agente veterinario o agente terapéutico humano para el tratamiento de una infección microbiana.