PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE AGENTES ANTIMICROBIANOS.

[0001] La presente invención se refiere al campo de la producción recombinante de agentes antimicrobianos, usando un dominio de protección que abarca entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos comprendidos en el dominio son D (asparagina, Asp) y/o E (glutamina, Glu). Antecedentes de la invención Antecedentes de la técnica [0002] WO 96/14413 divulga varios vectores de expresión usados para expresar lactoferrina humana recombinante en varias cepas de Aspergillus. Un plásmido de expresión, para la expresión en Aspergillus awamori, contiene el promotor de glucoamilasa, secuencia de señal, y secuencia que codifica 498 aminoácidos de la endógena proglucoamilasa de Aspergillus awamori, fusionada a la lactoferrina humana. Para la expresión de lactoferrina humana en Aspergillus oryzae, el plásmido de expresión incorpora el gen AMY II de Aspergillus oryzae que codifica el promotor de alfa-amilasa, la secuencia de señal secretora y el primer codón de alfa-amilasa madura. Para la expresión de lactoferrina humana en Aspergillus nidulans, el plásmido de expresión incorpora 300 bp de la secuencia flanqueadora 5' del gen alcA de A. nidulans conteniendo todos los elementos reguladores necesarios para la expresión genética controlada, incluyendo el promotor de alcohol deshidrogenasa de A. nidulans. [0003] WO 96/28559 divulga la expresión de determinadas proteínas antimicrobianas catiónicas como proteínas de fusión con una parte aniónica para la supresión de la actividad antimicrobiana de la proteína catiónica. Ejemplos de péptidos portadores aniónicos son la glutatión S-transferasa, la proteína A de estafilococo áureo, dos dominios de unión de IgG sintéticos (ZZ) de proteína A, y proteína de membrana externa F de Pseudomonas aeruginosa. [0004] WO 98/54336 divulga la expresión de determinadas proteínas antimicrobianas como proteínas de fusión con un péptido ácido cargado negativamente con al menos dos residuos de cisteína. [0005] WO 00/75344 divulga la expresión de un polipéptido exógeno como fusiones con pectato liasa usando varios enlaces, por ejemplo (repeticiones de) PEPT (SEC ID nº: 79), EPTP (SEC ID nº: 80), PTEP (SEC ID nº: 81), TPEP (SEC ID nº: 82) o IEGR (SEC ID nº: 83). Ejemplos de polipéptidos exógenos son la insulina humana de cadena única, GLP1 humano, y varias alfa-amilasas. [0006] Okamoto et al en Plant Cell Physiol. 39(1):57-63 (1998) divulga la expresión del péptido antimicrobiano Sarcotoxin IA mediante fusión de GUS en plantas de tabaco transgénicas. GUS designa la secuencia codificante de proteína de beta-glucuronidasa. [0007] Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos mejorados para la producción de agentes antimicrobianos. Resumen de la invención [0008] En un primer aspecto, la invención se refiere al uso, en la producción recombinante de un péptido antimicrobiano, de un dominio de extinción que sirve para desactivar temporal y reversiblemente el péptido durante su expresión, donde el dominio de extinción se funde al péptido antimicrobiano, donde el dominio de extinción engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos comprendidos en el dominio de extinción son D y/o E. La invención también se refiere a un método de identificación de tales dominios de extinción. [0009] En un segundo aspecto, la invención se refiere a una célula huésped microbiana recombinante comprendiendo una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un agente antimicrobiano, una segunda secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica una enzima, y una secuencia de ADN que codifica un péptido de protección de la invención, en el que el polipéptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano y en el que el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. Cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos, preferiblemente ambas, se pueden integrar en el cromosoma de la célula huésped, o pueden estar presentes en una o más entidades extracromosómicas. [0010] En un tercer aspecto, la invención se refiere a una constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un agente antimicrobiano, y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la enzima y el agente antimicrobiano en un huésped de expresión adecuado, donde la segunda secuencia de ácidos nucleicos es heteróloga al huésped de expresión; y una secuencia de ADN que codifica un péptido de protección de la invención, en el que el polipéptido de protección se fusiona al péptido antimicrobiano y en el que el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. [0011] En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para producir la enzima y/o el agente antimicrobiano mediante el uso de la célula huésped recombinante de la invención. 2 [0012] En un quinto aspecto, la invención se refiere a productos de fusión comprendiendo una enzima, un agente antimicrobiano, un enlace escindible que conecta la enzima y el agente antimicrobiano, y un péptido de protección de la invención, en el que el polipéptido de protección se fusiona al péptido antimicrobiano y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped, al igual que su uso en alimento para animales y aditivos de pienso animal. [0013] En un sexto aspecto, la invención se refiere al uso de la coexpresión de un péptido antimicrobiano y una enzima y un péptido de protección de la invención, en el que el polipéptido de protección se fusiona al péptido antimicrobiano y en el que el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped, como una herramienta para mejorar el rendimiento del péptido y/o para mejorar la economía de la producción total. Descripción detallada de la invención [0014] Generalmente, siempre que se menciona "un" aquí significa "al menos uno," por ejemplo en el contexto de la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos, el agente antimicrobiano, la enzima, y las varias construcciones de ADN. [0015] La presente invención se refiere a la coexpresión de al menos una enzima con al menos un agente antimicrobiano usando un péptido de protección (un dominio de extinción), en el que el péptido de protección se fusiona al péptido antimicrobiano, en el que el péptido de protección engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y en el que al menos el 50% de los residuos de aminoácidos son D y/o E (Asp y/o Glu). La enzima y el agente antimicrobiano se pueden coexpresar del cromosoma de las células huéspedes, de distintas construcciones de ADN, de una construcción de ADN, o usando una mezcla de estas técnicas. Al usar construcciones diferentes, se pueden utilizar diferentes marcadores de selección, y diferentes orígenes de replicación. Cuando se usa sólo una construcción, los genes se pueden expresar a partir de uno o más promotores. Si se clona bajo la regulación de un promotor (di o multicistrónico), el orden en que los genes son clonados puede afectar a los niveles de expresión de las proteínas. La enzima y el agente antimicrobiano pueden también ser expresados como una proteína de fusión, es decir, que el gen que codifica la enzima se ha fusionado en el marco del gen que codifica el agente antimicrobiano. Si el agente antimicrobiano influyera negativamente en el crecimiento de la célula huésped elegida, la actividad antimicrobiana se extinguiría mediante la expresión del péptido como una fusión con un péptido de protección (un dominio de extinción), donde el péptido de protección engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos son D y/o E (Asp y/o Glu). Agente antimicrobiano [0016] En el presente contexto, el término un agente antimicrobiano designa un compuesto con actividad antimicrobiana (ver a continuación). Ejemplos de agentes antimicrobianos son los péptidos antimicrobianos y las enzimas antimicrobianas. [0017] Ejemplos de enzimas antimicrobianas son las enzimas que disgregan la pared celular, generan compuestos tóxicos, eliminan nutrientes esenciales, o desactivan compuestos esenciales para el crecimiento de microorganismos indeseados. La lisozima (una enzima con una actividad de 1,4 beta acetilmuramidasa) es un ejemplo de una enzima antimicrobiana que disgrega la pared celular de bacterias Gram positivas. Las oxidasas, tales como la glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), genera peróxido de hidrógeno, que es tóxico para muchos microorganismos indeseados. Otros ejemplos de enzimas antimicrobianas que generan compuestos tóxicos son xantina oxidasa, lactoperoxidasa, lipasa, mieloperoxidasa, y fosfolipasa. La glucosa oxidasa es también... [Seguir leyendo]

1. Uso de un péptido de protección en la expresión recombinante de un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, donde el péptido de protección engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos comprendidos en el péptido de protección son D (Asp) y/o E (Glu), donde el péptido de protección se funde al péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 2. Método para identificar un péptido de protección que engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos comprendidos en el péptido de protección son D (Asp) y/o e (Glu), comprendiendo el método: a) proporcionar un candidato de protección peptídica que engloba entre 1 y 100 residuos de aminoácidos, y donde al menos el 50% de los residuos de aminoácidos comprendidos en el péptido de protección son D (Asp) y/o E (Glu); b) preparar un constructo de ADN comprendiendo una primera secuencia de ADN que codifica el candidato de protección peptídica y una segunda secuencia de ADN que codifica un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana; c) transformar una célula huésped con el constructo de ADN de b) y cultivar la célula huésped transformada para obtener expresión del constructo de ADN; d) estimar la viabilidad de la célula huésped transformada y/o el rendimiento del péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana; y e) identificar un candidato de protección peptídica que cuando se usa en un constructo de ADN según el paso b), para la transformación de una célula huésped según la fase c), resulta en una viabilidad aumentada de la célula huésped, y/o un rendimiento aumentado del péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, cuando se estima según el paso d). 3. Célula huésped microbiana recombinante comprendiendo una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, una segunda secuencia heteróloga de ácidos nucleicos que codifica una enzima, y una secuencia de ADN que codifica un péptido de protección tal y como se define en la reivindicación 1; donde el péptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 4. Célula huésped según la reivindicación 3, donde la primera y/o la segunda secuencia de ácidos nucleicos está/están integrada/s en el cromosoma de la célula huésped. 5. Célula huésped según la reivindicación 3, que contiene un constructo de ADN que incorpora tanto la primera como la segunda secuencia de ácidos nucleicos. 6. Célula huésped según la reivindicación 3, donde la primera secuencia de ácidos nucleicos se incorpora en un primer constructo de ADN y la segunda secuencia de ácidos nucleicos se incorpora en un segundo constructo de ADN. 7. Célula huésped según la reivindicación 6, comprendiendo además un tercer constructo de ADN que incorpora tanto la primera como la segunda secuencia de ácidos nucleicos. 8. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana; una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima, conectada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la enzima y el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana en un huésped de expresión adecuado, donde la segunda secuencia de ácidos nucleicos es heteróloga al huésped de expresión; y una secuencia de ADN que codifica un péptido de protección según la reivindicación 1; y donde el péptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 9. Método para la producción de una enzima y/o un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, comprendiendo el método: (a) cultivo de la célula huésped recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 3-7 para producir un sobrenadante comprendiendo la enzima y el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana; y (b) recuperación de la enzima y/o el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana. 10. Producto de fusión comprendiendo una enzima, un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y un péptido de protección tal y como se define en la reivindicación 1; donde el péptido de protección está localizado entre la enzima y el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana. 11. Aditivo de pienso comprendiendo a) al menos un producto de fusión según la reivindicación 10, b) al menos una vitamina liposoluble, y/o 98   c) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o d) al menos un oligoelemento. 12. Composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un producto de fusión según la reivindicación 10. 13. Planta transgénica, o parte de planta capaz de expresar una enzima, un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y un péptido de protección tal y como se define en la reivindicación 1; donde el péptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 14. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, capaz de expresar una enzima, un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y un péptido de protección tal y como se define en la reivindicación 1; donde el péptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 15. Uso del producto de fusión según la reivindicación 10 en pienso para animales. 16. Uso de coexpresión de un péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, una enzima, y un péptido de protección tal y como se define en la reivindicación 1 como una herramienta para mejorar el rendimiento del péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana y/o para mejorar la economía de producción global; donde el péptido de protección se fusiona con el péptido antimicrobiano o enzima antimicrobiana, y donde el efecto antimicrobiano inhibe el crecimiento de la célula huésped. 99