Un método para obtener una planta con una resistencia aumentada al estrés,

que comprende

a. introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:

i. Un promotor expresable en plantas;

ii. Una región de ADN que codifica una enzima de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido procedente de una levadura o de hongos, estando seleccionada dicha enzima entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa o nicotinamida adenina dinucleótido sintetasa;

iii. Una región del extremo 3'', implicada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación;

b. regenerar dichas células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas;

c. seleccionar una planta, a partir de dicha población de plantas transgénicas, que exhiba una resistencia aumentada al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar

Plantas resistentes al estrés.

Se proporcionan unos métodos para aumentar la resistencia al estrés en plantas y células de plantas, con los que las enzimas implicadas en la ruta de síntesis de salvación del NAD (dinucleótido de nicotinamida y adenina) y/o en la ruta de síntesis de novo del NAD son expresadas en plantas.

La tolerancia de ciertas plantas frente a condiciones desfavorables de crecimiento, incluyendo sequía, altas intensidades de luz, altas temperaturas, limitaciones de nutrientes, condiciones salinas de crecimiento y similares, es una propiedad muy deseada para plantas cultivadas, a la vista de la demanda, que nunca termina, de aumentar definitivamente el rendimiento real de estas plantas.

Se han descrito diversas maneras de alcanzar esta meta de mejorar lo que corrientemente se conoce como la resistencia al estrés o la tolerancia al estrés de plantas. Puesto que unas diferentes condiciones de estrés abiótico dan como resultado frecuentemente la generación de perjudiciales especies oxigenadas reactivas ("ROS", acrónimo de Reactive Oxygen Species), tales como superóxidos o peróxidos de hidrógeno, los intentos iniciales de mejorar la resistencia al estrés en plantas se enfocó en la prevención de la generación de las ROS o en la eliminación de las mismas. Ejemplos de estos enfoques son una sobreexpresión de enzimas depuradoras de las ROS tales como catalasas, peroxidasas, superóxido dismutasas, etc., o incluso aumentar la cantidad de moléculas depuradoras de las ROS tales como ácido ascórbico, glutatión, etc. Estos enfoques y otros intentos de tratar por ingeniería genética a plantas tolerantes al estrés, se recopilan, p. ej., en la cita de Wang y colaboradores, 2003, Planta 218:1-14.

Una tolerancia al estrés en las células de plantas y las plantas se puede conseguir también reduciendo la actividad o el nivel de las poli-ADP-ribosa polimerasas (ParP) o de las poli(ADP-ribosa) glicohidrolasas (ParG) endógenas, tal como se describe en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 00/04173 y WO 2004/090140, respectivamente. Se cree que, de esta manera, un agotamiento fatal del NAD y ATP en células de plantas sometidas a unas condiciones de estrés, que dan como resultado una muerte traumática de las células, se puede evitar o posponer de una manera suficiente para que las células estresadas sobrevivan y se aclimaten a las condiciones de estrés.

Uchimiya y colaboradores (2002) describen el aislamiento de un gen de arroz designado como YK1, así como el uso de un gen YK1 quimérico para aumentar la tolerancia de plantas de arroz transgénicas, que albergan ese gen, al tizón del arroz y a diversos estreses abióticos, tales como NaCl, UV-C, sumergencia y peróxido de hidrógeno. (Uchimiya y colaboradores, 2002, Molecular breeding (crianza molecular) 9: 25-31).

Uchimiya y colaboradores publicaron además un resumen de cartel que describe que una sobreexpresión de un gen de reductasa dependiente del NAD (YK1) en células de arroz también activaba y favorecía el nivel del NAD(P)(H) mediante regulación en sentido ascendente de las actividades del NAD, y sacaron la conclusión de que esta modificación, a su vez, generaba una agrupación de sustancias redox que se necesitan para una resistencia al estrés causado por las ROS (Uchimiya y colaboradores 2003 Keystone symposium on Plant biology: Functions and control of cell death (simposio de Keystone sobre biología vegetal. Funciones y control de la muerte celular), Snowbird Utah 10-15 de Abril, 2003).

Una NAD sintetasa procedente de una levadura ha sido bien caracterizada y es la última enzima tanto en la ruta de síntesis de novo del NAD como en la ruta de salvación del NAD (véase la Figura1). En la ruta de novo, un quinolato es el precursor para la síntesis del NAD y es generado como un producto de degradación del triptófano. En la ruta de salvación, la nicotinamida (que es un producto de degradación del NAD, generado a través de la acción de diversas enzimas tales como las PARP, desacetilasas dependientes del NAD u otras glicohidrolasas del NAD) es la molécula precursora. En una primera operación, la nicotinamida es desamidada mediante una nicotinamidasa para formar ácido nicotínico. El ácido nicotínico es transferido a un 5-fosforribosil-1-pirofosfato por la enzima nicotinato fosforribosiltransferasa para proporcionar un ácido nicotínico mononucleótido. Este compuesto es compartido entre la ruta de novo y la ruta de salvación. Por lo tanto, una conversión ulterior de este compuesto mediante una NAD+ pirofosforilasa y una NAD sintetasa se consigue igual a como en la ruta de novo.

En una levadura, una sobreexpresión de PNC1 (que codifica la nicotinamidasa) ha sido correlacionada con una prolongación de tramos de vida por restricción de calorías y con un estrés de baja intensidad (Anderson y colaboradores, 2003 Nature 423: páginas 181-185; Gallo y colaboradores, 2004, Molecular and Cellular Biology 24: 1301-1312).

Se sabe poco acerca de las respectivas enzimas de las rutas de biosíntesis del NAD en plantas. Hunt y colaboradores, 2004, describen el uso de la información genómica disponible a partir de Arabidopsis con el fin de identificar los homólogos vegetales (en plantas) de estas enzimas (Hunt y colaboradores, 2004, New Phytologist 163(1): 31-44). Las secuencias de DNA identificadas tienen los siguientes números de acceso: para la nicotinamidasa: At5g23220; At5g23230 y At3g16190; para la nicotinato fosforribosiltransferasa: At4g36940, At2g23420, y para la ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa: At5g55810 y para la NAD sintetasa: At1g55090.

Se requieren todavía unos métodos alternativos para aumentar la tolerancia al estrés en plantas, y las formas de realización que se describen aquí a continuación, incluyendo a las reivindicaciones, proporcionan tales métodos y medios.

Sumario del invento

En una forma de realización del invento, se proporciona un método para obtener una planta con una aumentada resistencia al estrés, que comprende introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, con lo cual el gen químerico comprende los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:

seguido por regenerar las células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas; y seleccionar una planta, a partir de la población de plantas transgénicas, que exhiba una aumentada resistencia al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar. La región de ADN puede codificar una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.:2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.:6; SEQ ID No.:8, SEQ ID No.:10.

En otra forma de realización, el invento se refiere a los genes quiméricos que se describen aquí, a células de plantas que comprenden estos genes quiméricos, y a plantas que se componen esencialmente de células de plantas que comprenden estos genes quiméricos, y a semillas de dichas plantas. Estas plantas y células de plantas pueden ser caracterizadas porque ellas tienen un más bajo nivel de especies oxigenadas reactivas en condiciones de estrés que una planta similar que no comprende uno de tales genes quiméricos.

En todavía otra forma de realización, el invento se refiere al uso de los genes quiméricos que se han descrito, con el fin de aumentar la resistencia al estrés de una planta o de disminuir el nivel de especies oxigenadas reactivas en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés.

El invento proporciona además el uso de una secuencia de ADN que codifica una enzima, funcional en plantas, de la ruta de síntesis de salvación del nicotinamida adenina dinucleótido, que se selecciona entre nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico...

1. Un método para obtener una planta con una resistencia aumentada al estrés, que comprende

a. introducir un gen quimérico dentro de las células de una planta para obtener células transgénicas, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN enlazados operativamente:

b. regenerar dichas células transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas;

c. seleccionar una planta, a partir de dicha población de plantas transgénicas, que exhiba una resistencia aumentada al estrés, o seleccionar una planta que exhiba un nivel reducido de especies oxigenadas reactivas o que mantenga un alto nivel de NADH en condiciones de estrés, cuando se compare con una planta no transgénica similar.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región de ADN codifica una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6; SEQ ID No.:8 y SEQ ID No.:10.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región de ADN comprende la secuencia de nucleótidos de: SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:5, SEQ ID No.:7, SEQ ID No. 9 o SEQ ID No.:3.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la operación de cruzar dicha planta con otra planta.

5. Un gen quimérico, como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Una célula de planta, que comprende un gen quimérico como se describe en la reivindicación 5.

7. Una planta, que comprende un gen quimérico como se describe en la reivindicación 5.

8. La planta de la reivindicación 7, que es una planta seleccionada entre algodón, hortalizas del género Brassica, colza de semillas oleaginosas, trigo, maíz o maíz dulce, cebada, girasol, arroz, avena, caña de azúcar, hortalizas, achicoria, lechuga, tomate, tabaco, patata, caña de azúcar, papaya, piña, mango o Arabidopsis thaliana.

9. La planta de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada además porque tiene un nivel más bajo de especies oxigenadas reactivas en condiciones de estrés que una planta similar que no comprende dicho gen quimérico.

10. Una semilla de una planta de acuerdo con la reivindicación 7 o con la reivindicación 8, que comprende un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5.

11. Uso de un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5, para aumentar la resistencia al estrés de una planta.

12. Uso de un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5, para disminuir el nivel de especies oxigenadas reactivas en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés o para mantener el nivel del NAD en una planta o en una célula de planta en condiciones de estrés.