MÉTODOS PARA ALTERAR LA REACTIVIDAD DE PAREDES CELULARES DE PLANTAS.

Un método para incrementar la cantidad de oligosacáridos cargados positivamente o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular,

particularmente la pared celular secundaria de una célula vegetal, comprendiendo dicho método i. introducir mediante transformación un gen quimérico en la célula vegetal, comprendiendo dicho gen quimérico: a. un promotor expresable por planta; b. una región de ADN que codifica una quitina sintasa que comprende una secuencia de anclaje señal para seleccionar como dianas a las membranas del aparato de Golgi, o una proteína de nodulación C; y c. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación, en el que dicha quitina sintasa o proteína de nodulación C se expresa en dicha célula vegetal

Métodos para alterar la reactividad de paredes celulares de plantas La presente invención se refiere a la modificación de la reactividad de las paredes celulares de plantas, incluyendo paredes celulares de plantas secundarias, particularmente como se pueden encontrar en fibras naturales de plantas productoras de fibras. En particular, la presente invención se refiere a métodos para obtener fibras de algodón con reactividad alterada. La reactividad modificada se podría aplicar en métodos para teñir material derivado de planta que contiene pared celular tal como fibras naturales, usando colorantes reactivos con la fibra, para mejorar, por ejemplo, la durabilidad del color, o para reducir los volúmenes de efluentes gastados usados durante el proceso de tinción. La reactividad modificada se podría aplicar también para mejorar la reactividad de las fibras naturales con agentes reaccionantes tales como retardantes de la llama, agua, aceite y repelentes de la suciedad, agentes contra los pliegues, suavizantes, agentes antiestáticos, agentes de blanqueamiento fluorescente, etc.

Antecedentes de la invención Las fibras naturales, incluyendo fibras naturales que contienen celulosa procedentes de plantas, tales como algodón y lino, se han usado por la humanidad desde hace más de 5000 años. Sin embargo, las fibras que contienen celulosa natural no poseen la versatilidad química de las fibras sintéticas, debido a la naturaleza inerte relativa de la celulosa, que consiste en monómeros de glucosa enlazados 1-1-4.

Esta naturaleza inerte relativa es, por ejemplo, manifiesta durante el proceso de tinción de fibras de algodón y tejidos. Generalmente se usan dos tipos de colorantes para teñir el algodón: los colorantes directos, y los colorantes reactivos con fibra, los cuales son ambos moléculas aniónicas. El propio algodón desarrolla una carga aniónica en agua, de modo que, sin tratamiento especial, la absorción de colorante por la fibra o el tejido es bastante elaborada.

Los colorantes directos crean un enlace de hidrógeno relativamente débil con el polímero de celulosa, formando una unión semipermanente. Los colorantes directos son más fáciles de usar y más baratos que los colorantes reactivos con fibra, pero no soportan bien el lavado. Los colorantes reactivos con fibra son moléculas que combinan cromóforos con un grupo reactivo que forma fuertes enlaces covalentes con la fibra por medio de la reacción con grupos hidroxilo. Los enlaces covalentes proporcionan una buena resistencia de la fibra teñida frente al lavado. La durabilidad del color se puede mejorar usando fijadores catiónicos.

Durante el proceso de tinción, se necesitan grandes cantidades de electrolitos para proteger los colorantes aniónicos frente a las cargas aniónicas de la fibra. Los colorantes sin reaccionar (hasta 40%) tienen que ser eliminados a través de una etapa de lavado conocida como arenado, generando grandes volúmenes de efluentes, que también contienen los electrolitos mencionados anteriormente.

Por lo tanto, la provisión de una carga eléctrica positiva a la fibra de celulosa, por ejemplo incorporando compuestos químicos cargados positivamente, podría mejorar la capacidad de coloración de las fibras de celulosa natural, así como mejorar cualquier reacción química de la fibra de celulosa modificada con compuestos químicos cargados negativamente. También haría posible el uso de colorantes ácidos.

Varias publicaciones han descrito la incorporación en o el revestimiento de oligómeros de quitosano en fibras de celulosa para obtener mezclas de quitosano-celulosa, hilos o tejidos. El quitosano es un polímero cargado positivamente de glucosamina, que se puede obtener mediante desacetilación de quitina, por ejemplo mediante tratamientos alcalinos. La propia quitina es un polímero de N-acetilglucosamina (GlcNac) enlazado 1-1-4.

La solicitud de patente US 2003/0123120 describe el revestimiento de fibras naturales con quitosano.

Liu et al. (Carbohydrate Polymers 44 (2003) 233-238) describe un método para revestir fibras de algodón con quitosano, mediante oxidación del hilo de algodón con per y odato potásico a 60ºC en agua, y tratamiento subsiguiente con una disolución de quitosano en ácido acético acuoso. Con el revestimiento de quitosano, la superficie de la fibra de algodón se torna fisiológica y biológicamente activa. Puesto que la reactividad química del grupo amino es mayor que la del grupo hidroxilo de monómeros de celulosa, la fibra tiene más potencial para la modificación química adicional. Además, la superficie lisa de la fibra de algodón se torna áspera, sugiriendo un mayor potencial para la absorción de fármaco y la liberación controlada del mismo.

Basándose en la función fisiológica de quitosano para inhibir, por ejemplo, dermatofitos, muchas ropas, tejidos y fibras funcionales emplean fibras con mezcla de celulosa-quitosano, conjugados de fibra de celulosa con quitosano, y tejidos revestidos con resinas que contienen quitosano.

El documento WO 00/09729 describe la expresión de genes de quitina sintasa y de quitina desacetilada para alterar la pared celular para usos industriales y resistencia mejorada a enfermedades. Específicamente, los usos citados son: proporcionar una única fuente vegetal de celulosa, quitina y quitosano, incrementar la resistencia a la tracción, e incrementar la ruptura frágil. Los genes de quitina sintasa sugeridos específicamente derivan de organismos fúngicos. No se proporcionan datos experimentales sobre la producción de quitina o quitosano en las plantas, ni sobre la incorporación de los mismos en las paredes celulares de plantas.

La técnica anterior sigue así careciendo de la provisión de métodos para obtener plantas a partir de las cuales se pueden aislar paredes celulares de plantas, particularmente paredes celulares secundarias, tales como fibras naturales, que contengan grupos químicos cargados positivamente y/o grupos químicos que son más reactivos que los grupos hidroxilo de celulosa. Estos y otros problemas se resuelven como se describe en lo sucesivo en las diferentes realizaciones, ejemplos y reivindicaciones.

Sumario de la invención Brevemente, en una realización, la invención proporciona un método para incrementar la cantidad de oligosacáridos cargados positivamente o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular, particularmente en la pared celular secundaria de una célula vegetal, que comprende introducir un gen quimérico en la célula de la planta, por medio de lo cual el gen quimérico comprende un promotor expresable por la planta ligado operablemente a una región de ADN que codifica una N-acetilglucosamina transferasa, en la que la N-acetilglucosamina transferasa es una quitina sintasa que comprende una secuencia de anclaje señal para dirigirla a las membranas del aparato de Golgi; y una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación. En una realización particular, la planta es algodón, y los oligosacáridos y polisacáridos cargados positivamente se incorporan en las paredes de la célula secundaria que constituyen la fibra de algodón.

En otra realización de la invención, se proporciona un método para incrementar la cantidad de oligosacáridos cargados positivamente o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular, particularmente la pared celular secundaria de una célula vegetal, que comprende introducir un gen quimérico en la célula vegetal, comprendiendo el gen quimérico un promotor expresable por la planta ligado operablemente a una región de ADN que codifica una proteína de nodulación C; y una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Nuevamente, en una realización específica, la planta es algodón, y los oligosacáridos y polisacáridos cargados positivamente se incorporan en las paredes celulares secundarias que constituyen la fibra de algodón.

También se describe un método para incrementar la cantidad de oligosacáridos o polisacáridos en la pared celular, particularmente la pared celular secundaria de una célula vegetal, comprendiendo el método i. introducir un gen quimérico en la célula vegetal, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN enlazados operablemente:

1. un promotor expresable por la planta;

2. una región de ADN que codifica quitina sintasa; y

3. una terminación de la transcripción de una región de poliadenilación,

ii. aplicar a la célula vegetal transgénica una cantidad eficaz de N-acetilglucosamina, glucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato,... [Seguir leyendo]

1. Un método para incrementar la cantidad de oligosacáridos cargados positivamente o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular, particularmente la pared celular secundaria de una célula vegetal, comprendiendo dicho método i. introducir mediante transformación un gen quimérico en la célula vegetal, comprendiendo dicho gen quimérico:

a. un promotor expresable por planta;

b. una región de ADN que codifica una quitina sintasa que comprende una secuencia de anclaje señal para seleccionar como dianas a las membranas del aparato de Golgi, o una proteína de nodulación C; y

c. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación, en el que dicha quitina sintasa o proteína de nodulación C se expresa en dicha célula vegetal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha quitina sintasa comprende una secuencia de anclaje señal seleccionada de la secuencia de anclaje señal de una sialil transferasa de rata, la secuencia de anclaje señal de una galactosil transferasa humana, la secuencia de anclaje señal del homólogo de Arabidopsis del receptor HDEL de levadura (AtERD2) , la secuencia de anclaje señal de la a-2, 6-sialiltransferasa, la secuencia de anclaje señal de 11, 2-xilosiltransferasa de Arabidopsis thaliana, la secuencia de anclaje señal de N-acetilglucosaminil transferasa I del tabaco, o la secuencia de aminoácidos YYHDL o LKLEI.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha quitina sintasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No 15 desde la posición 1 hasta la posición 35.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha quitina sintasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No 15.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha región de ADN codifica una proteína de nodulación C obtenible de una especie de Rhizobium, una especie de Azorhizobium, una especie de Bradyrhizobium, una especie de Mesorhizobium, una especie de Ralstonia, una especie de Streptomyces, una especie de Burkholderia, una especie de Cupriavidus o una especie de Sinorhizobium.

6. El método de las reivindicaciones 1 y 5, en el que dicha proteína de nodulación C comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No 1, SEC ID No 2, SEC ID No 3, SEC ID No 4, SEC ID No 5, SEC ID No 6, SEC ID No 7, SEC ID No 8, SEC ID No 9, CAA67139, CAA608779, CAA51774, CAA51773, CAA25811, CAA25810, CAA25814, CAA68619, CAA2350, CAD31533, CAC05896, CAH04369, CAB56055, NP_629203, P26024, P17862, BAB524500, AAX30050, AAX30049, E38180, JQ0396, ZZZRC4, ZZZRCL, A95321, C23766, C26813, NP_659761, NP_443883, NP_106714, NP_768667, NP_435719, BAC47292, AAU11365, AAU11364, AAU11363, AAU11362, AAU11361, AAU11360, AAU11359, AAU11358, AAU11357, AAU11356, AAU11355, AAU11354, AAU11353, AAU11352, AAU11351, AAU11350, AAU114349, AAU11348, AAU11347, AAU11346, AAU11345, AAU11344, AAU11343, AAU11342, AAU11341, AAU11340, AAU11339, AAU11338, AAK65131, AAS91748, P04679_2, P04679_1, P04679, P72334, Q53513, P50357, P04678, P50536, P53417, Q07755, P04341, P04340, P24151, P04677, CAD90588, CAD90587, CAD90586, CAD90585, CAD90584, CAD90583, CAD90257, CAD43933, AAM54775, AAN62903, S34305, S09522, S07304, AAL88670, CAD29957, CAD29956, CAD29955, CAD29954, CAD29953, CAD29952, CAD29951, CAD29950, CAD29949, CAC42489, AAK53549, AAK53548, AAK50872, AAK39967, AAK39966, AAK39965, AAK39964, AAK39963, AAK39962, AAK39961, AAK39960, AAK39959, AAK39958, AAK39957, AAK39956, AAG44125, AAK00157, AAG60998, AAB71694, AAB16897, AAV80567, AAB95329, BAA24092, BAA06089, BAA06086, BAA06085, BAA06083, BAA06090, BAA06082, BAA06087, BAA06088, BAA06084, AAB91695, AAB51164, AAB47353, AAB34509, AAB24745, 1615305E, 1615305D, 165305C, CAA26311, CAA26310, CAA3731, AAA63602 ó 26226.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho promotor expresable por planta es un promotor seleccionado del promotor específico de fibras de un gen de beta-tubulina de algodón, un promotor específico de fibras de un gen de actina de algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos de algodón, un promotor de un gen de expansina de algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en algodón.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha planta se selecciona de algodón, cáñamo o lino.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la pared celular de la planta en dicha planta de algodón comprende fibras.

10. El método de las reivindicaciones 1-9, que comprende además la etapa de tratar dicha pared celular con una disolución alcalina, durante un tiempo suficiente para desacetilar dicho oligosacárido que consiste en monómeros de N-acetilglucosamina.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además la etapa de aislar dicha 5 pared celular de la planta o dichas fibras.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha pared celular de la planta es una pared celular secundaria de la planta.

13. Una célula vegetal que comprende un gen quimérico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Una planta que consiste esencialmente en células vegetales de la reivindicación 13.

15. La planta de la reivindicación 14, que es algodón.

16. Un gen quimérico como se define en las reivindicaciones 1-4.

17. Uso de un gen quimérico de la reivindicación 16 para incrementar la cantidad de oligosacáridos cargados

positivamente en la pared celular de una célula vegetal, o para incrementar la reactividad de las paredes celulares 15 de la planta para modificaciones químicas de tales paredes celulares de la planta.

Figura 1 Figura 1 continuación Figura 2 Figura 2 continuación Figura 3 79 80 81 82 83 84