Una planta de Brassica napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas desengrasada y seca,

de menos que 30 micromoles/g, que comprende en el cromosoma 8 un gen de resistencia a Leptosphaeria maculans que se deriva de Brassica rapa subespecies sylvestris, en que dicha planta de Brassica napus se deriva de unas semillas que se depositaron bajo el número de accesión al ATCC PTA-5410, y en que dicho gen está flanqueado por los marcadores de AFLP E32/M50-M362 y P34/M48-M283 en el cromosoma N08 en estas semillas

Planta de Brassica resistente al hongo Leptosphaeria maculans (pie negro).

Campo del invento

El invento se refiere al sector de la represión de enfermedades fúngicas en Brassica napus. Se proporcionan unas plantas y semillas de B. napus, que comprenden un lugar (locus) de resistencia al hongo pie negro (necrosis del cuello de crucíferas), que se deriva del cromosoma 8 de B. rapa, en su genoma. También se proporcionan unas plantas y semillas de B. napus que comprenden por lo menos dos o por lo menos tres lugares (loci) de resistencia al pie negro, situados en diferentes cromosomas, en su genoma. Se proporcionan además unas herramientas de detección para detectar la presencia de unos o más alelos de resistencia en plantas, tejidos o semillas de B. napus, así como unos métodos para transferir uno o más lugares de resistencia a otras plantas de Brassica y unos métodos para combinar diferentes lugares de resistencia en semillas y plantas híbridas. Se proporcionan también unos métodos para aumentar la durabilidad de la resistencia a L. maculans, así como unos usos de las plantas y semillas y de los procedimientos del invento.

Técnica de antecedentes

El pie negro o chancro de tallo es una enfermedad principal de Brassica napus L. (colza de semilla oleaginosa o Canola), causando anualmente unas muy grandes pérdidas económicas en todo el mundo, en particular en Europa, Australia y América del Norte. El pie negro es causado por el patógeno fúngico Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & De Not. (anamorfo Phoma lingam Tode ex. Fr.). Se pueden desarrollar síntomas de L. maculans en cotiledones, hojas, vainas y tallos. Unas lesiones de hojas se desarrollan después de una infección por ascosporas dispersadas en el viento y/o conidiosporas dispersadas en agua (por salpicadura). Unos síntomas (o chancros) de tallos pueden surgir mediante una infección directa de los tallos o mediante un crecimiento sistémico del hongo a partir de lesiones de hojas, a través del tejido vascular dentro del tallo [Hammond y colaboradores, (1985), Plant Pathology 34:557-565]. Los chancros de tallo pueden descortezar al tallo, lo cual puede conducir al acostamiento o aposentamiento de las plantas y a la muerte de las plantas. Unos chancros menos graves pueden causar una restricción en el flujo de agua y de nutrientes, lo cual a su vez puede conducir a un acorchamiento de semillas y vainas. Una infección de vainas puede conducir a una prematura desintegración (rotura en añicos) de las vainas y a una infección de las semillas.

La incorporación de una resistencia al pie negro en cultivares de B. napus es uno de los principales objetivos en programas de crianza por todo el mundo. Aunque tanto la atomización o pulverización de fungicidas como las prácticas de cultivo se usan para reducir las pérdidas de rendimiento causadas por una infección por pie negro, el método de represión más confiable hasta la fecha es una resistencia genética.

La Brassica napus (2n = 38, genoma AACC) es una especie anfidiploide, que se originó a partir de una hibridación espontánea de Brassica rapa L. (sinónimos B. campestris; 2n = 20, AA) y de Brassica oleracea L. (2n = 18, CC). La B. napus contiene los grupos completos de cromosomas de estos dos genomas diploides.

Una resistencia al pie negro es comprobada o bien en un invernadero o en experimentos realizados en el campo. En una forma de realización, se comprueba preferiblemente una resistencia al pie negro en experimentos realizados en el campo, y se puede comprobar en diferentes estadios del desarrollo de las plantas. Cuando se hace referencia a una resistencia al pie negro, normalmente se distinguen por lo tanto diferentes tipos de resistencias, dependiendo del estadio de la planta y del tejido que se ha comprobado, tal como una resistencia de plántulas (resistencia "precoz") y una resistencia de plantas adultas (resistencia "tardía" o del "tallo"). Los tejidos de plantas analizados en cuanto a la resistencia son, por ejemplo, cotiledones, hojas y bases de tallos. Se ha informado de que una resistencia genética al pie negro es o bien monogénica (está bajo el control de un gen principal) o poligénica (está bajo el control de varios genes menores o secundarios).

Se han cartografiado un cierto número de lugares de resistencia en B. napus. Por ejemplo, se informó de que un único lugar de resistencia dominante, designado como LEM1, está situado en el grupo de engarce 6 (que es ahora conocido por los autores del invento por ser el cromosoma N07 en la nomenclatura de Sharpe y colaboradores (1995, Genome 38:1112-1121)) de B. napus cv. Major, basándose en inoculaciones de heridas (lesiones) de plántulas [Fereirra y colaboradores, (1995), Genetics 85 (2): 213-217]. La resistencia en el campo en plantas adultas, en el cv. Cresor de primavera, fue cartografiada en el cromosoma N07 por Dion y colaboradores, [(1995), TAG 91: 1190-1194] y designada como LmFr. Se informó de que los cultivares Maluka y Shiralee tienen un lugar principal que controla la resistencia de las plántulas, designada como LmR1, en el cromosoma N07 [Mayerhofer y colaboradores (1997), Genome 40: 294-301.]. Rimmer y colaboradores, [(1999), Proceedings of the 10^th International Rapeseed Congress [Actas del 10º Congreso Internacional sobre semillas de colza] informaron también sobre unos lugares de resistencia, designados como RLM, en el cromosoma N07.

Sin embargo, la falta de una adecuada resistencia hallada en Brassica napus (genoma AACC) y la continua amenaza de descomposición de la resistencia cuando un cultivar resistente se usa de un modo ampliamente propagado y durante más largos períodos de tiempo, ha conducido a los criadores y científicos a investigar unas alternativas fuentes de resistencia. El foco principal se ha dirigido hacia la identificación y la transferencia de alelos de resistencia a partir de especies de Brassica relacionadas tales como B. rapa (AA), B. oleracea (CC), B. nigra (genoma BB), B. juncea (genoma AABB) y B. carinata (BBCC).

Una fuente principal de resistencia al pie negro es el genoma B. Gerdemann-Knörck informaron en 1994 sobre la introducción de una resistencia al pie negro dentro de B. napus a partir de B. nigra por una hibridación somática asimétrica [Gerdemann-KnÓrck y colaboradores (1994), Plant Breeding 113:106-113].

Otro enfoque ha consistido en generar los denominados linajes de B. napus "sintéticos" por una hibridación interespecífica de dos especies diploides (genomas AA y CC) y unos subsiguientes procesos de cultivo in vitro de los embriones y de duplicación de los cromosomas.

La resistencia al pie negro se introdujo en B. napus de esta manera generando unas plantas de B. napus sintéticas a partir de accesiones silvestres de B. rapa (genoma AA) [Crouch y colaboradores (1994), Plant Breeding 112: 265-278] y de accesiones silvestres de B. atlantica (genoma CC) [Mithen y Magrath (1992), Plant Breeding 108: 60-68, y Mithen y Herron (1991) Proceedings of the 8^th International Rapeseed Congress].

Seis accesiones de B. rapa ssp sylvestris silvestre se cruzaron con B. oleracea ssp alboglabra con el fin de desarrollar una serie de linajes de B. napus sintéticos con un genoma C común pero con diferentes genomas A [Crouch y colaboradores, (1994), supra]. Se encontró que los B. rapa ssp sylvestris #75 y #76 son resistentes a materiales aislados de pie negro en unos ensayos realizados en invernaderos (ensayos con cotiledones y hojas), mientras que el B. rapa ssp sylvestris #29 era susceptible. Dos de los linajes sintéticos derivados de los #75 o #76 y B. oleracea ssp alboglabra, y sus híbridos F1 con cultivares de colza de semilla oleaginosa, mostraron una alta resistencia al pie negro en experimentos en realizados en invernaderos. Solamente uno de estos linajes mostró también resistencia en experimentos realizados en el campo, en Inglaterra y Australia.

Crouch (tesis doctoral, universidad de Anglia oriental, Norwich, Reino Unido) describe unos marcadores de RFLP engarzados a unas regiones del genoma que contribuyen a la resistencia en el campo, el cartografiado de estas regiones para cinco grupos de engarce y la localización de lugares con rasgos cuantitativos (QTL, acrónimo de quantitative trait loci) que contribuyen a la resistencia en diferentes tejidos. El análisis de intervalos...

1. Una planta de Brassica napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas desengrasada y seca, de menos que 30 micromoles/g, que comprende en el cromosoma 8 un gen de resistencia a Leptosphaeria maculans que se deriva de Brassica rapa subespecies sylvestris, en que dicha planta de Brassica napus se deriva de unas semillas que se depositaron bajo el número de accesión al ATCC PTA-5410, y en que dicho gen está flanqueado por los marcadores de AFLP E32/M50-M362 y P34/M48-M283 en el cromosoma N08 en estas semillas.

2. La planta de la reivindicación 1, que produce un aceite, después de haber triturado las semillas, que contiene menos de 2% de ácido erúcico de los ácidos grasos totales en el aceite.

3. La planta de la reivindicación 1 ó 2, en la que el componente sólido de la semilla contiene menos de 30 micromoles de cualquiera o cualquier mezcla de los compuestos glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4-pentenilo, glucosinolato de 2-hidroxi-3-butenilo y glucosinolato de 2-hidroxi-4-pentenilo por gramo de material sólido exento de aceite, secado al aire.

4. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es estéril masculina.

5. La planta de la reivindicación 4, que comprende un transgén que puede hacer estériles masculinas a las plantas.

6. La planta de la reivindicación 5, en la que dicho transgén es un gen de barnasa.

7. La planta de la reivindicación 4, que se generó usando un sistema citoplasmático de esterilidad masculina.

8. Una planta obtenida a partir de las plantas de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans y en la que se ha restaurado la fertilidad.

9. La planta de la reivindicación 8, que comprende un transgén capaz de inhibir o evitar la actividad del gen de esterilidad masculina.

10. La planta de la reivindicación 9, en la que dicho transgén es un gen barstar.

11. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es una planta híbrida.

12. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans está asociado con por lo menos un marcador de AFLP seleccionado entre el grupo que consiste en: P34/M48-M283, E32/M50-M362 y E36/M51-M171.1.

13. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans está asociado con por lo menos un marcador de AFLP seleccionado entre el grupo que consiste en E32/M50-M362 y P34/M48-M283.

14. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que se deriva de las semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410.

15. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además en su genoma por lo menos un adicional gen de resistencia a Leptosphaeria maculans.

16. La planta de la reivindicación 15, en la que dicho gen de resistencia adicional está situado en los cromosomas N10, N14 y/o N07, o en la que dicho gen de resistencia adicional procede de uno cualquiera de los siguientes cultivares de B. napus: Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola60, o Surpass 400.

17. Semillas de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans.

18. Las semillas de la reivindicación 17, que son semillas híbridas.

19. Las semillas de la reivindicación 17 ó 18, que se derivan de las semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410.

20. Un método para detectar la presencia o ausencia del gen de resistencia a Leptosphaeria maculans de la reivindicación 1 en el ADN de un tejido o unas semillas de B. napus, que comprende:

21. Uso de una cualquiera de los marcadores de AFLP E32/M50-M362, E36/M51-M171.1 y P34/M48-M283, para vigilar la introgresión del gen de resistencia a Leptosphaeria maculans de la reivindicación 1 en plantas de Brassica napus, o para un análisis de AFLP de plantas de Brassica napus.

22. Uso de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para producir un aceite de colza de semilla oleaginosa o una torta de semillas de colza de semilla oleaginosa.