NUEVAS PROTEINAS INSECTICIDAS DE BACILLUS THURINGIENSIS.

Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se- cuencia de aminoácidos de una variante de la proteína de SEQ ID No.

4, en donde dicha variante tiene 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del control de plagas de las plantas, parti-cularmente control de los insectos. Se proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico procedentes de cepas de Bacillus thuringiensis (Bt), que codifican proteínas insecticidas expresadas durante las etapas de crecimiento vegetativo. Particularmente, se proporcionan 10 secuencias de DNA que codifican una proteína designada como ISP3-327D, que son útiles para proteger las plantas contra el deterioro causado por los insectos. Se proporcionan adi-cionalmente plantas y microorganismos que comprenden al menos una de las nuevas molé-culas de ácido nucleico, así como métodos y medios para utilizar estas secuencias de ácido nucleico para reducir el deterioro de las plantas causado por los insectos. 15

Antecedentes de la técnica

Las plagas de insectos causan enormes pérdidas económicas mundialmente en la producción de cosechas, y los agricultores se enfrentan todos los años a la amenaza de pérdidas de rendimiento debida a la infestación por insectos. La ingeniería genética de re-sistencia a los insectos en las cosechas agrícolas ha constituido un enfoque atractivo para 20 reducir los costes asociados con la gestión de las cosechas y las prácticas de control de los productos químicos. Las primeras generaciones de cosechas resistentes a los insectos se han introducido en el mercado desde 1996, basadas en la expresión en plantas de proteínas aisladas de la bacteria gram-positiva del suelo Bacillus thuringiensis (Bt)). Las proteínas insecticidas Cry de Bt se producen durante la etapa de esporulación de cepas Bt y las pro-25 teínas se acumulan en grandes cristales citoplásmicos en el interior de la bacteria. Cuando son consumidas por los insectos, una proteína Cry de Bt típica tóxica para los Lepidópteros se solubiliza y se procesa en el intestino medio de los insectos en una forma activa de aproximadamente 60 a 65 kDa. La proteína activa ejerce su efecto físico por fijarse a las células epiteliales del intestino medio, causando la formación de poros en la membrana 30 celular, lo que conduce a la lisis osmótica de las células (Gill et al., 1992).

Una cepa Bt puede producir muchas toxinas diferentes. Desde el aislamiento de la primera proteína insecticida cristalina codificada por el gen de Bt en 1981 (Schnepf y White-ley, 1989) han sido clonados más de 100 genes codificantes de toxinas Cry de Bt y han sido controladas eficazmente plagas de insectos por expresión de proteínas derivadas de Bt en 35 importantes especies de cosechas agrícolas. Sin embargo, el uso de proteínas Bt individua-les se ve limitado a menudo, dado que la mayoría de las proteínas Bt son principalmente activas sólo contra un número relativamente pequeño de las numerosas plagas de insectos

existentes. Se cree que la especificidad de las proteínas Cry de Bt viene determinada por factores tales como la activación de la toxina en el intestino del insecto (Haider et al., 1986) y su capacidad para fijar receptores específicos (Hoffmann et al., 1988).

Esta ampliamente reconocido que existe el riesgo de que las especies de insectos susceptibles puedan desarrollar resistencia contra las toxinas Cry de Bt. Por consiguiente, 5 se han realizado esfuerzos activos para identificar nuevas proteínas insecticidas. Una estra-tegia, que ha sido utilizada, consistía en cribar cepas de Bacillus para la producción de pro-teínas insecticidas durante las etapas de crecimiento vegetativo, en lugar de hacerlo durante las etapas de esporulación. Utilizando este enfoque, han sido identificadas varias "proteínas insecticidas vegetativas" o "VIPs". 10

Estruch et al. (1996), WO94/21795, WO96/10083, WO98/44137, US 5,877,012, US 6,107,279, US 6,137,033 y US 6,291,156 describen el aislamiento de vip3A(a), vip3A(b) y vip3A(c) a partir de fluidos sobrenadantes de las cepas BT AB88, AB424 y AB51. De acuer-do con los autores, estos genes codifican proteínas con actividad insecticida frente a una extensa gama de plagas de insectos Lepidópteros. 15

WO 98/18932 y WO 99/57282 describen cierto número de secuencias de nucleóti-dos aisladas de cepas Bt. A estas secuencias se hace referencia como mis (mis-1 a mis-8), war y sup. De acuerdo con los autores, las proteínas codificadas tienen actividad contra plagas de Lepidópteros o Coleópteros.

WO 00/09697 describe toxinas termolábiles, de tipo soluble MIS y de tipo WAR, así 20 como toxinas de menor tamaño (1 a 10 kDa), que pueden obtenerse a partir del sobrena-dante de cultivos de cepas de Bacillus laterosporus, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra las larvas de la Oruga de las Raíces del Maíz Occidental.

WO 98/00546 y US 6.274.721 describen el aislamiento de cepas Bt y toxinas Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de Lepidópteros. 25

WO 99/33991 describe el aislamiento de cepas Bt y toxinas Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de Lepidópteros.

Recientemente, Selvapandiyan et al. (2001) han descrito el aislamiento de un gen que codifica una proteína designada como VIP-S. De acuerdo con los autores, la proteína VIP-S exhibía toxicidad contra cierto número de especies de insectos Lepidópteros. 30

Doss et al. (2002) describen la clonación de VIP3V a partir de la cepa krustaki de Bt.

WO 02/078437 describe toxinas VIP3 de Bt, tales como las toxinas híbridas VIP3A, VIP3B y VIP3A-B.

A pesar del aislamiento y caracterización de un número relativamente grande de diferentes proteínas insecticidas hasta la fecha, persiste la necesidad de identificación, ais-35 lamiento y caracterización de nuevas proteínas insecticidas. Las razones para esto son múltiples. En primer lugar, debido a la especificidad de las proteínas insecticidas para gru-pos particulares de plagas diana, (espectros de insectos hospedadores), hay necesidad de

clonar genes que codifiquen proteínas con diferentes espectros de actividad, a fin de que para diferentes cosechas y diferentes regiones geográficas estén disponibles proteínas ade-cuadas para combatir plagas de insectos. La especificidad de las proteínas Cry de Bt, por ejemplo, es muy limitada. La identificación de toxinas con especificidad para diferentes in-sectos diana sigue siendo deseable. En segundo lugar, después del uso prolongado en una 5 región geográfica, se sabe que los insectos tienen capacidad para desarrollar resistencia frente a los insecticidas químicos, pulverizaciones microbianas (basadas por ejemplo en mezclas de cristales de esporas Bt), y se cree que tienen capacidad para desarrollar resis-tencia frente a las plantas que expresan proteínas insecticidas. El desarrollo de resistencia en las poblaciones de insectos podría hacer potencialmente ineficaces las proteínas insecti-10 cidas existentes, dando lugar a una necesidad de nuevos genes y proteínas. En tercer lugar, por razones de salud y ambientales, es deseable identificar proteínas con potencia insectici-da alta específica y bioactividad aguda frente a especies de insectos diana.

En lo sucesivo, con inclusión de las diferentes realizaciones descritas en las reivindicaciones, se describen nuevas secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos 15 aisladas de cepas de Bacillus thuringiensis, que son útiles para proteger las plantas contra el deterioro causado por los insectos, sea por la expresión de las secuencias de ácido nu-cleico en las plantas bajo el control de promotores adecuados, o por aplicación externa de las toxinas a las plantas. Las toxinas de la presente invención son distintas de las toxinas plaguicidas descritas anteriormente. 20

Sumario de la invención

La invención proporciona proteínas ISP3 insecticidas y ácidos nucleicos codificantes de las mismas. Se proporciona la proteína insecticida ISP3-327D (SEQ ID No. 4) y los áci-dos nucleicos que codifican la misma, isp3-327D (SEQ ID No. 3). La proteína de la inven-ción tiene actividad insecticida contra plagas de insectos Lepidópteros, particularmente 25 contra insectos seleccionados del grupo constituido por Helicoverpa zea, Helicoverpa armi-gera, Helicoverpa punctigera, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medina-lis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Pseudoplu-sia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogalli, Epinotia aporema...

1. Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se-cuencia de aminoácidos de una variante de la proteína de SEQ ID No. 4, en donde dicha variante tiene 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación 5 con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína.

2. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ ID No. 4 en donde dicha variante tiene menos de 5 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación con la proteína de SEQ ID No. 4 10 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína.

3. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha pro-teína comienza con un dipéptido Met-Asp o Met-Ala, por inserción de un codón que codifica un aminoácido Asp o Ala aguas abajo del codón de inicio en el DNA que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 15

4. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.

5. Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se-cuencia de aminoácidos del fragmento más pequeño de la proteína de SEQ ID No. 4 que retiene actividad insecticida, que se obtiene por digestión enzimática de la proteína de SEQ 20 ID No. 4 con fluido de jugo intestinal de Ostrinia nubilalis.

6. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es insecticida contra Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesa-mia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.

7. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de una cual-25 quiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, que comprende los nucleótidos 1 a 2367 de SEQ ID No. 3.

9. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, que es una se-cuencia sintética que ha sido optimizada para expresión en plantas monocotiledóneas o 30 plantas dicotiledóneas.

10. Un gen quimérico que comprende una secuencia promotora enlazada operati-vamente a una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. El gen quimérico de la reivindicación 10, que comprende también una región codificante que codifica un péptido de tránsito para direccionamiento a los cloroplastos o a 35 otros plastos, enlazada a la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

12. Un vector que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 ó 11.

13. Una célula hospedadora transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 ó 11.

14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es una célula vegetal.

15. La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es un microorganismo.

16. Una planta transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 5 ó 11.

17. La planta de la reivindicación 16, que es una planta de maíz, algodón, arroz o soja.

18. Un método de protección de una planta contra el deterioro causado por los insectos, que comprende poner en contacto dicha planta con la proteína insecticida de una 10 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha proteína insecticida es codifi-cada por un gen quimérico integrado en el genoma de dicha planta.

20. El método de la reivindicación 18, en donde dicha proteína se aplica externa-mente a dicha planta. 15

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde dicha planta es una planta de maíz, algodón, soja o arroz.

22. Una cepa de Bacillus thuringiensis transformada con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

23. Una composición insecticida que comprende la proteína de una cualquiera de 20 las reivindicaciones 1 a 6 que, cuando se aplica externamente a una planta, aumenta la resistencia al deterioro causado por los insectos comparada con las plantas de control a las que no se ha aplicado dicha composición.

24. El uso de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 contra una plaga de insectos Lepidópteros del algodón, el maíz, el arroz o la soja. 25

25. El uso de la reivindicación 24, en donde dicha plaga de insectos es Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y An-ticarsia gemmatalis.

26. El uso de la reivindicación 25, en donde dicha plaga de insectos es Scirphop-30 haga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.

27. La planta de la reivindicación 16, que expresa simultáneamente con la proteína de SEQ ID No. 4 o su fragmento o variante: una proteína Cry, una proteína Cry1F, un híbri-do derivado de una proteína Cry1F, una proteína de tipo Cry1A o un fragmento tóxico de la 35 misma, una proteína Cry1Ac o un híbrido derivado de la misma, una proteína Cry1Ab o un fragmento insecticida de la misma, una proteína Cry2Ae, una proteína VIP3Aa o un frag-

mento tóxico de la misma, o una proteína insecticida de cepas de especies de Xenorhab-dus, Serratia o Photorhabdus.

28. La planta de la reivindicación 27 que es maíz, arroz, algodón o soja.

29. La planta de la reivindicación 27 ó 28, que es una planta híbrida.

30. Uso de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 co-5 expresada en plantas de maíz, arroz, algodón o soja, en combinación con otra proteína de control de los insectos, en donde dicha otra proteína de control de los insectos es: una pro-teína Cry1Ac, una proteína Cry1Ab, una proteína Cry2Ae, o una proteína VIP3Aa o deriva-dos de la misma.

31. La célula vegetal de la planta de la reivindicación 14 o la planta de la reivindicación 16, que comprenden también un gen PAT que confiere resistencia a glufosinato de amonio, o un gen 2mEPSPS que confiere resistencia a glifosato.