Un método para producir una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin penalización sobre el rendimiento,

que comprende las operaciones de

a) introducir un gen quimérico en una célula de algodón, para generar una célula de algodón transgénico, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos 5 de ADN engarzados operativamente:

i) un promotor expresable en plantas:

ii) una región de ADN transcribible que comprende (1) una primera región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20;

(2) una segunda región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre dicha primera región de ADN;

en donde dicha primera región de ADN y dicha segunda región de ADN están en una orientación de repetición invertida una con respecto a la otra y en donde una molécula de ARN transcrito a partir de dicha reacción transcribible es capaz de formar una región de ARN de doble hebra entre una región de ARN transcrita a partir de dicha primera región de ADN y una región de ARN transcrita a partir de dicha segunda región de ADN; y iii) una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación, que es funcional en plantas;:

b) regenerar dicha célula de algodón transgénico para obtener una planta de algodón transgénico; y

c) identificar una planta de algodón transgénico que tiene una aptitud aumentada para resistir a condiciones de estrés por sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento en comparación con una planta de algodón no transformada.

Plantas de algodón tolerantes al estrés.

El siguiente invento se refiere a unas plantas de algodón modificadas que tienen una mayor aptitud que las plantas de algodón no modificadas de contrapartida para resistir una sequía sin condiciones que afecten al rendimiento particularmente condiciones de estrés abiótico, tales como, pero sin limitarse a, temperaturas bajas o altas, sequía, altas intensidades de luz, contaminación química, inundación, alta salinidad, altas intensidades de luz o alta irradiación con rayos UV (ultravioleta) . Tales plantas de algodón se pueden obtener disminuyendo la expresión del (de los) gen (es) parp2 de algodón endógenos, particularmente en condiciones de estrés por sequía.

Descripción de la técnica relacionada

Una poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) , también conocida como poli (ADP-ribosa) transferasa (ADPRT) (EC 2.4.2.30) , es una enzima nuclear que se halla en la mayor parte de los eucariotas, incluyendo a vertebrados, artrópodos, moluscos, mohos mucilaginosos, dinoflagelados, hongos y otros eucariotas de orden bajo con la excepción de las levaduras. La actividad enzimática ha sido demostrada también en un cierto número de plantas (Payne y colaboradores, 1976; Willmitzer y Wagner, 1982; Chen y colaboradores, 1994; O'Farrell, 1995) .

Una PARP cataliza la transferencia de un residuo de ADP-ribosa que se deriva de NAD+, principalmente al grupo carboxilo de un residuo de ácido glutámico en la proteína diana, y una subsiguiente polimerización de la ADP-ribosa. La principal proteína diana es una PARP propiamente dicha, pero también se ha mostrado que están sujetas a esta modificación las histonas, las proteínas cromosómicas con un grupo de alta movilidad, una topoisomerasa, endonucleasas y polimerasas de ADN.

La proteína PARP procedente de animales es una proteína nuclear de 113-120 kDa, abundante en la mayor parte de los tipos de células, que consiste en tres grupos funcionales principales: un dominio de fijación de ADN terminal de amino que contiene dos dominios de dedos de Zn, un dominio catalítico terminal de carboxi y un dominio interno que está auto-modificado (de Murcia y Ménissier de Murcia, 1994; Kameshita y colaboradores, 1984; Lindahl y colaboradores, 1995) . La actividad enzimática in vitro es aumentada en gran manera después de una fijación a roturas de una sola hebra en un ADN. La actividad in vivo es inducida por unas condiciones que dan como resultado eventualmente roturas de ADN (Álvarez-González y Althaus, 1989; Ikejima y colaboradores 1990) . La automodificación del dominio central sirve aparentemente como una regulación de la retroalimentación negativa de una PARP.

La actividad de una PARP en células de plantas se demostró por primera vez examinando la incorporación de 3H procedente de NAD+ marcado dentro de los núcleos de células de puntas de raíz (Payne y colaboradores, 1976; Willmitzer y Wagner, 1982) . La actividad enzimática fue también purificada parcialmente a partir de plántulas de maíz y se encontró que está asociada con una proteína con una masa molecular aparente de 113 kDa, sugiriendo que la PARP de plantas puede ser similar a la enzima procedente de animales (Chen y colaboradores, 1994; O'Farrell, 1995) .

Chen y colaboradores, (1994) han informado sobre una actividad de una PARP en núcleos de maíz y han asociado a esta actividad enzimática con la presencia de una proteína de aproximadamente 114 kDa presente en un extracto de núcleos de maíz.

O' Farrel (1995) informó que una amplificación por RT-PCR (= reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) en un ARN aislado a partir de maíz (usando unos cebadores degenerados basados en las secuencias conservadas de manera sumamente alta) daba como resultado un fragmento de 300 pb (pares de bases) , mostrando una identidad de un 60 % al nivel de los aminoácidos con la proteína PARP humana.

Lepiniec y colaboradores (1995) han aislado y clonado un ADNc de plena longitud a partir de Arabidopsis thaliana que codifica una proteína de 72 kDa con una alta similaridad con el dominio catalítico de una PARP de vertebrado. El dominio terminal de N de la proteína no revela ninguna similaridad de secuencias con el correspondiente dominio de una PARP procedente de vertebrados, pero se compone de cuatro tramos de aminoácidos (denominados A1, A2, B y C) que muestran una similaridad con el terminal de N de un cierto número de proteínas nucleares y de fijación de ADN. La estructura secundaria predicha de A1 y A2 era una estructura de hélice-bucle-hélice.

Mahajan y Zuo (1998) describieron la purificación y la clonación del ADNc (cromosomal) de una polimerasa de poli (ADP) -ribosa de maíz. La enzima es un único polipéptido de aproximadamente 115 kD (980 aminoácidos) , codificado por un cuadro de lectura abierto de 2.943 pb. La secuencia deducida de aminoácidos muestra una identidad de un 40 a 42 % y una similaridad de aproximadamente un 50 % con las conocidas secuencias de las PARP de vertebrados. Las características de la estructura modular de la molécula de una PARP, tales como dos dedos de zinc, una señal de localización nuclear putativa, el dominio de auto-modificación, y el dominio de fijación de NAD+, se conservan en la enzima de maíz.

Babiychuk y colaboradores (1998) describieron que dos homólogos de una poli (ADP-ribosa) polimerasa se encontraron en plantas, la clásica polimerasa que contiene dedos de Zn y las proteínas PARP no clásicas estructuralmente, que carecen del característico dominio de dedo de Zn en el terminal de N.

La nomenclatura actual se refiere a las clásicas polimerasas que contienen dedos de Zn tales como las proteínas PARP1 (y los correspondientes genes parp1) mientras que las proteínas PARP no clásicas estructuralmente se mencionan a actualmente como PARP2 (y los correspondientes genes parp2) .

Se podrían identificar las siguientes entradas en bases de datos que identifican secuencias demostradas y putativas de proteínas de poli (ADP-ribosa) polimerasa, partes de las mismas o secuencias homólogas: BAD53855 (Or y za sativa) ; BAD52929 (Or y za sativa) ; XP_477671 (Or y za sativa) ; BAC84104 (Or y za sativa) ; AAT25850 (Zea mays) ; AAT25849 (Zea mays) ; NP_197639 (Arabidopsis thaliana) ; NP_850165 (Arabidopsis thaliana) ; NP_188107 (Arabidopsis thaliana) ; NP_850586 (Arabidopsis thaliana) ; BAB09119 (Arabidopsis thaliana) ; AAD20677 (Arabidopsis thaliana) ; Q11207 (Arabidopsis thaliana) ; C84719 (Arabidopsis thaliana) ; T51353 (Arabidopsis thaliana) ; T01311 (Arabidopsis thaliana) ; AAN12901 (Arabidopsis thaliana) ; AAM13882 (Arabidopsis thaliana) ; CAB80732 (Arabidopsis thaliana) ; CAA10482 (Arabidopsis thaliana) ; AAC79704 (Zea mays) : AAC19283 (Arabidopsis thaliana) ; CAA10888 (Zea mays) ; CAA10889 (Zea mays) ; y CAA88288 (Arabidopsis thaliana) .

Amor y colaboradores, (1998) describieron la implicación de una PARP en la respuesta a un estrés oxidativo en plantas. Los autores mostraron que en células de soja cultivada, una PARP está implicada en respuestas a estreses abióticos suaves y severos, mediando en la reparación de los ADN y en procesos de muerte celular programada, respectivamente.

El documento de solicitud de patente internacional WO99/37789 describe composiciones y métodos para influir el estado metabólico de células de plantas. Las composiciones comprenden genes de poli (ADP-ribosa) polimerasas y porciones de los mismos, particularmente el gen de una poli (ADP-ribosa) polimerasa de maíz así como secuencias de nucleótidos antisentido para genes de poli (ADP-ribosa) polimerasas. Las secuencias de nucleótidos encuentran uso en la transformación de células de plantas con el fin de alterar el estado metabólico de las plantas y las células de plantas transformadas.

El documento WO 00/04173 describe medios y métodos para modular una muerte celular programada (PCD = acrónimo de programmed cell death) en células y organismos eucarióticos, particularmente en células de plantas y plantas, por introducción de genes quiméricos que modulan una PCD, influyendo sobre la expresión y/o la actividad aparente de genes de una poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) endógena. La muerte celular programada puede ser inhibida o provocada. El invento se refiere particularmente al uso de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas con la actividad de una PARP para modular una PCD, para intensificar la velocidad o tasa de crecimiento o para producir células y organismos tolerantes al estrés.

La técnica anterior, por lo tanto, sigue siendo deficiente... [Seguir leyendo]

1) Un método para producir una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin penalización sobre el rendimiento, que comprende las operaciones de a) introducir un gen quimérico en una célula de algodón, para generar una célula de algodón transgénico, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN engarzados operativamente: i) un promotor expresable en plantas: ii) una región de ADN transcribible que comprende

(1) una primera región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20;

(2) una segunda región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre dicha primera región de ADN; en donde dicha primera región de ADN y dicha segunda región de ADN están en una orientación de repetición invertida una con respecto a la otra y en donde una molécula de ARN transcrito a partir de dicha reacción transcribible es capaz de formar una región de ARN de doble hebra entre una región de ARN transcrita a partir de dicha primera región de ADN y una región de ARN transcrita a partir de dicha segunda región de ADN; y

iii) una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación, que es funcional en plantas;: b) regenerar dicha célula de algodón transgénico para obtener una planta de algodón transgénico; y c) identificar una planta de algodón transgénico que tiene una aptitud aumentada para resistir a condiciones de estrés por sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento en comparación con una planta de algodón no transformada.

2) El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótidos de dicho gen parp2 o dicho ADNc de parp2 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que a su vez comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No.: 21 o SEQ ID No.: 22.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos de dicho gen parp2 o dicho ADNc de parp2 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 15.

4) El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que dicha primera y dicha segunda regiones de ADN comprenden por lo menos 50 nucleótidos consecutivos.

5) El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que dicha primera y dicha segunda regiones de ADN comprenden por lo menos 200 nucleótidos consecutivos.