Un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una planta por una secuencia de ADN de interés,

que comprende las siguientes etapas: a. inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado dicho sitio preseleccionado en dicha secuencia de ADN diana o en la vecindad de dicha secuencia de ADN diana; b. introducir una molécula de ADN de interés en dicha célula vegetal, comprendiendo dicha molécula de ADN i. dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea dicha secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea dicho sitio preseleccionado en el genoma de dicha célula vegetal; ii. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y otra copia de al menos parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa indicada como secuencia de ADN flanqueante parcial; iii. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa; c. seleccionar una población de células vegetales que comprenden dicho marcador seleccionable o identificable; d. seleccionar una célula vegetal en la que dicho marcador seleccionable o identificable se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de dichas regiones de ADN flanqueantes, y regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal; e. cruzar dicha planta regenerada o una planta descendiente de esta última, que comprende dicho gen marcador seleccionable, con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima DSBI, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente: iv. un promotor específico de microspora; v. una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés; vi. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación; f. seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende dicho gen marcador seleccionable o identificable y dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; g. cruzar dicha planta descendiente con otra planta, con lo que dicha planta descendiente se usa como donante de polen; h. seleccionar una población de plantas descendientes (población F2) que comprenden dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y i. seleccionar una planta descendiente en la que dicho gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante recombinación homóloga entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes

Campo de la invención

La actual invención se refiere a métodos y medios para el intercambio exacto en células vegetales y en plantas de una secuencia de ADN diana por una secuencia de ADN de interés a través de recombinación homóloga, con lo que el marcador seleccionable o identificable usado durante la fase de recombinación homóloga para la selección temporal de los sucesos de sustitución génica se puede eliminar subsiguientemente sin dejar una huella y sin recurrir al cultivo in vitro durante la etapa de eliminación.

Antecedentes de la técnica

La eliminación de subfragmentos seleccionados de ADN extraño introducido en células vegetales o en plantas, pero que se han convertido subsiguientemente en obsoletos o incluso indeseados, por diversas razones, tras la introducción de los mismos, ha sido el objeto de una intensa investigación. Los ejemplos de tales secuencias son, por ejemplo, genes marcadores seleccionables que fueron necesarios para el aislamiento de plantas transgénicas pero que ya no son necesarios en las plantas maduras. Los métodos para lograr la eliminación eficaz de los mismos se basan mayoritariamente en la recombinación específica del sitio o en la transposición (véase, por ejemplo, Hohn et al., Plant Bio-Technology p 139-143).

Siebert y Puchta (2002) describieron que las secuencias transgénicas flanqueadas por sitios de una enzima de restricción de corte rara se pueden cortar eficazmente del genoma de un eucariota superior mediante recombinación homóloga, así como mediante unión de extremos no homólogos.

El documento WO 03/004659 se refiere a sistemas de recombinación y a un método para eliminar una secuencia de ácido nucleico del ADN cromosómico de organismos eucariotas. El documento también se refiere a organismos transgénicos (preferiblemente plantas), que contienen los sistemas descritos o producidos por los métodos descritos.

Sin embargo, los métodos descritos requieren en su mayoría el uso de un método de cultivo in vitro para identificar o seleccionar aquellas células vegetales en las que ha tenido lugar la eliminación de las secuencias de ADN a eliminar, y para generar una planta a partir de tales células.

La Solicitud de Patente US 2005/0060769 propone un método para preparar una planta o célula vegetal de Zea mays transgénica recombinada a partir de una primera célula vegetal de Zea mays transgénica, en el que el transgén en la planta o célula vegetal recombinante tiene una estructura genética alterada con relación a la estructura genética del transgén en la primera célula vegetal transgénica, debido a la eliminación transgénica mediada por recombinación homóloga.

El documento WO 97/30166 o la patente US 6.407.314 describe fragmentos promotores procedentes de un gen específico de microsporas del tabaco, que se pueden usar para la expresión de genes en microsporas.

El problema que se ha resuelto por la presente invención se refiere al intercambio seleccionado y exacto a través de recombinación homóloga de una secuencia de ADN diana en una célula de una planta por una secuencia de ADN de sustitución sin dejar huellas del procedimiento, y sin tener que recurrir a métodos de cultivo in vitro después de la etapa inicial de recombinación homóloga. Para este fin, se pueden usar convenientemente los métodos para la eliminación eficaz de la subsecuencia seleccionada de una parte de una molécula de ADN previamente insertada en el genoma, preferiblemente el genoma nuclear de células de una planta, a través de recombinación homóloga intracromosómica.

La necesidad de controlar el sitio de integración transgénica en plantas se ha reconocido desde muy temprano, y se han desarrollado varios métodos en un esfuerzo para satisfacer esta necesidad (para un repaso, véase Kumar y Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, p. 155-159). Estos métodos se basan en su mayoría en la integración transgénica basada en recombinación homóloga, una estrategia que se ha aplicado con éxito en procariotas y eucariotas inferiores (véase, por ejemplo, el documento EP 0317509, o la publicación correspondiente de Paszkowski et al., 1988, EMBO J., 7, p. 4021-4026). Sin embargo, para las plantas, el mecanismo predominante para la integración transgénica se basa en una recombinación ilegítima que implica poca homología entre las hebras de ADN que se recombinan. Por lo tanto, un reto importante en esta área es la detección de los sucesos de recombinación homóloga raros, que están enmascarados por la integración mucho más eficaz del ADN extraño introducido vía recombinación ilegítima.

Una manera de resolver este problema es seleccionando frente a los sucesos de integración que se han producido mediante recombinación ilegítima, tal como se ejemplifica en el documento WO 94/17176.

Otra manera de resolver el problema es mediante la activación del locus diana a través de la inducción de rupturas de ADN bicatenarias vía endonucleasas que cortan de forma rara, tales como I-SceI. Se ha demostrado que esta técnica incrementa la frecuencia de recombinación homóloga en al menos dos órdenes de magnitud usando agrobacterias para suministrar el ADN de reparación a las células vegetales (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, p. 5055-5060).

El documento WO 96/14408 describe un AND aislado que codifica la enzima I-SceI. Esta secuencia de ADN se puede incorporar en vectores de clonación y de expresión, estirpes celulares transformadas y en animales transgénicos. Los vectores son útiles en el cartografiado de genes y en la inserción de genes dirigida al sitio.

El documento WO 00/46386 describe métodos para modificar, reparar, atenuar e inactivar un gen u otro AND cromosómico en una célula a través de una ruptura bicatenaria mediante I-SceI. También se describen métodos para tratar o para la profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que lo necesite. Se describen además endonucleasas de restricción quiméricas.

Chilton y Que (2003, Plant Physiol. 133: p. 956-965) y Tzifira et al. (2003, Plant Physiol. 133: p. 1011-1023) informan que el ADN T se integra preferentemente en rupturas de ADN bicatenarias, inducidas artificialmente por las enzimas que escinden de forma rara I-SceI o I-CeuI. Los informes también incluyeron vectores de ADN T donantes que comprendían un sitio de reconocimiento para la enzima respectiva que escinde de forma rara.

Sin embargo, los métodos en la técnica anterior se basan frecuentemente en la reformación o generación, a través de recombinación homóloga, de un gen marcador seleccionable o identificable intacto.

Por lo tanto, todavía sigue existiendo la necesidad de métodos que permitiesen el intercambio selecto de virtualmente cualquier secuencia de ADN diana mediante un ADN de sustitución. Estos y otros problemas se resuelven como se describe en lo sucesivo en las diferentes realizaciones detalladas de la invención, así como en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

En una realización de la invención, se proporciona un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma, particularmente el genoma nuclear, de una planta por una secuencia de ADN de interés, que comprende las siguientes etapas:

a. inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado el sitio preseleccionado en la secuencia de ADN diana o en la vecindad de la secuencia de ADN diana;

b. introducir una molécula de ADN de interés en la célula vegetal, comprendiendo la molécula de ADN

i. la secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia, preferiblemente 100% de homología de secuencia, con una región de ADN que flanquea a la secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea al sitio preseleccionado en el genoma de la célula vegetal;

ii. un gen marcador seleccionable o identificable si

tuado entre las regiones de ADN flanqueantes, estando situado además el gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial, que comprende parte de la una de las regiones de ADN flanqueantes, situada en la repetición directa;

iii. un sitio de reconocimiento para una enzima que escinde de forma rara, inductora de una ruptura de ADN bicatenaria (DSBI), situado entre la una de las regiones de ADN...

1. Un método para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una planta por una secuencia de ADN de interés, que comprende las siguientes etapas:

a. inducir una primera ruptura de ADN bicatenaria en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, estando localizado dicho sitio preseleccionado en dicha secuencia de ADN diana o en la vecindad de dicha secuencia de ADN diana;

b. introducir una molécula de ADN de interés en dicha célula vegetal, comprendiendo dicha molécula de ADN

i. dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea dicha secuencia de ADN diana, y preferiblemente que flanquea dicho sitio preseleccionado en el genoma de dicha célula vegetal;

ii. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable

o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y otra copia de al menos parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes situada en la repetición directa indicada como secuencia de ADN flanqueante parcial;

iii. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa;

c. seleccionar una población de células vegetales que comprenden dicho marcador seleccionable o identificable;

d. seleccionar una célula vegetal en la que dicho marcador seleccionable o identificable se ha introducido mediante recombinación homóloga a través de dichas regiones de ADN flanqueantes, y regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal;

e. cruzar dicha planta regenerada o una planta descendiente de esta última, que comprende dicho gen marcador seleccionable, con una planta que comprende un gen quimérico que codifica la enzima DSBI, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes segmentos de ADN enlazados operablemente:

iv. un promotor específico de microspora;

v. una región de ADN que codifica una enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés;

vi. una región de terminación de la transcripción y de poliadenilación;

f. seleccionar una planta descendiente (planta F1) que comprende dicho gen marcador seleccionable o identificable y dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI;

g. cruzar dicha planta descendiente con otra planta, con lo que dicha planta descendiente se usa como donante de polen;

h. seleccionar una población de plantas descendientes

(población F2) que comprenden dicho gen quimérico que codifica la enzima DSBI; y

i. seleccionar una planta descendiente en la que dicho gen marcador seleccionable o identificable se suprime mediante recombinación homóloga entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha primera ruptura bicatenaria en dicho sitio preseleccionado es inducida por introducción de una primera enzima inductora de DSBI, no reconociendo dicha primera enzima inductora de DSBI dicho sitio de reconocimiento para una enzima inductora de DSBI situada en dicho ADN de interés.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha primera enzima DSBI y dicha enzima DSBI que reconoce dicho sitio de reconocimiento situado en dicho ADN de interés son dos enzimas DSBI diferentes seleccionadas del grupo de I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I o PI-Tsp I, o una endonucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN de dedo de Zn y un dominio de escisión de ADN.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enzima inductora de DSB que reconoce dicho sitio de reconocimiento para una enzima inductora de DSBI situado en dicho ADN de interés es I-SceI.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha región de ADN que codifica dicha enzima inductora de una ruptura de ADN bicatenaria comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID No 1 o SEC ID No 2.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho promotor específico de microspora comprende un promotor seleccionado de la secuencia nucleotídica de SEC ID No 3 o un fragmento funcional de la misma.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho gen quimérico que codifica DSBI comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID No 6 del nucleótido 1941 a 3913.

8. Un vector de ADN para intercambiar una secuencia de ADN diana en el genoma de una célula vegetal por una secuencia de ADN de interés a través de la inducción de una ruptura bicatenaria en un sitio preseleccionado dentro de dicha secuencia diana o en su vecindad, comprendiendo dicho vector de ADN

a. dicha secuencia de ADN de interés situada entre dos regiones de ADN flanqueantes que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con una región de ADN que flanquea a dicha secuencia de ADN diana y que flanquea a dicho sitio preseleccionado;

b. un gen marcador seleccionable o identificable situado entre dichas regiones de ADN flanqueantes, estando situado además dicho gen marcador seleccionable o identificable entre una de las regiones de ADN flanqueantes y una región de ADN flanqueante parcial que comprende parte de dicha una de las regiones de ADN flanqueantes

situada en la repetición directa; y

c. un sitio de reconocimiento para una enzima DSBI situado entre dicha una de las regiones de ADN flanqueantes y dicha región de ADN flanqueante parcial situada en la repetición directa.