SUCESO ÉLITE A5547-127 Y KITS PARA IDENTIFICAR TAL SUCESO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS.

Suceso élite A5547-127 y métodos y kits para identificar tal suceso en muestras biológicas Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos y a kits para identificar en muestras biológicas la presencia de material vegetal que comprende específicamente el suceso de transformación A5547-127, así como plantas de haba de soja transgénicas, material vegetal y semillas que contienen tal suceso. Las plantas de haba de soja de la invención combinan el fenotipo tolerante a herbicidas con un comportamiento agronómico, estabilidad genética y adaptabilidad a diferentes trasfondos genéticos equivalente a la línea de haba de soja no transformada en ausencia de presión de malas hierbas. Antecedentes de la invención La expresión fenotípica de un transgén en una planta está determinada tanto por la estructura del propio gen como por su localización en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgén (en un ADN extraño) en diferentes localizaciones en el genoma influirá en el fenotipo global de la planta de diferentes maneras. La introducción agronómica o industrialmente con éxito de un rasgo comercialmente interesante en una planta por manipulación genética puede ser un procedimiento laborioso que depende de diferentes factores. La transformación y regeneración reales de plantas transformadas genéticamente son sólo la primera en una serie de etapas de selección, que incluyen caracterización genética amplia, reproducción, y evaluación en pruebas de campo, que conducen finalmente a la selección de un suceso élite. La identificación inequívoca de un suceso élite está adquiriendo importancia creciente en vista de las discusiones acerca de Nuevos Alimentos y Piensos, segregación de productos GMO y no GMO, y la identificación de material patentado. Idealmente, dicho método de identificación es tanto rápido como simple, sin necesidad de un montaje amplio de laboratorio. Adicionalmente, el método debería proporcionar resultados que permitan la determinación inequívoca del suceso élite sin interpretación de expertos, pero que soporte el escrutinio de expertos en caso necesario. A5547-127 se seleccionó como un suceso élite en el desarrollo de haba de soja (Glycine max L.) resistente al herbicida Liberty®, por transformación de haba de soja con un plásmido que comprende el gen pat sintético que codifica la tolerancia a la fosfinotricina y se puede vender comercialmente como haba de soja Liberty Link®. Las herramientas para uso en métodos simples e inequívocos a fin de identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas se describen en esta memoria. Sumario de la invención La presente invención se refiere a métodos para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, métodos que están basados en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5 y/o 3 de A5547-127. La materia objeto de la presente invención se define por las reivindicaciones. De modo más específico, la invención se refiere a un método que comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en muestras biológicas, usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de los cuales reconoce la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, reconociendo el otro una secuencia dentro del ADN extraño, preferiblemente para obtener un fragmento de ADN de un tamaño comprendido entre 100 y 500 pb. Los cebadores pueden reconocer una secuencia en la región flanqueante de 5 de A5547-127 (SEC ID nº 1, desde la posición 1 hasta la posición 311) o en la región flanqueante de 3 de A5547-127 (complemento de SEC ID nº 2, desde la posición 510 hasta la posición 1880), y una secuencia en el ADN extraño (complemento de SEC ID nº 1, desde la posición 312 a 810, o SEC ID nº 2, desde la posición 1 hasta la posición 510), respectivamente. El cebador que reconoce la región flanqueante de 5 puede comprender la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 15, y el cebador que reconoce una secuencia en el ADN extraño puede comprender la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13 descrita en esta memoria. La presente invención se refiere más específicamente a un método para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, método el cual comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en una muestra biológica, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tienen la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 15 y SEC ID nº 13 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de alrededor de 151 pb. La presente invención se refiere adicionalmente a las secuencias flanqueantes específicas de A5547-127 descritas en esta memoria, que se pueden usar para desarrollar métodos específicos de identificación para A5547-127 en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere a las regiones flanqueantes de 5 y/o 3 de A5547- 2   127 que se pueden usar para el desarrollo de cebadores y sondas específicos como se describe posteriormente aquí. La invención se refiere adicionalmente a métodos de identificación para determinar la presencia de A5547-127 en muestras biológicas basados en el uso de tales cebadores o sondas específicos. Los cebadores puede consistir en una secuencia nucleotídica de 17 a alrededor de 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEQ ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, o el complemento de la secuencia nucleotídica de SEQ ID 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, combinados con cebadores que consisten en una secuencia nucleotídica de 17 a alrededor de 200 nucleótidos consecutivos seleccionados del complemento de la secuencia nucleotídica de SEQ ID No 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810, o la secuencia nucleotídica de SEQ ID No 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 510. Los cebadores también pueden comprender estas secuencias nucleotídicas localizadas en su extremo 3, y pueden comprender además secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias nucleotídicas mencionadas, pero que comprenden desemparejamientos. La invención se refiere adicionalmente a kits para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, comprendiendo dichos kits al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127. El kit de la invención puede comprender, además de un cebador que reconoce específicamente la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, un segundo cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN extraño de A5547-127, para uso en un protocolo de identificación mediante PCR. Preferiblemente, el kit de la invención comprende dos cebadores específicos, uno de los cuales reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante de 5 de A5547-127, y reconociendo el otro una secuencia en el ADN extraño. Especialmente, el cebador que reconoce la región flanqueante de 5 puede comprender la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 14, y el cebador que reconoce el transgén puede comprender la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13 o cualquier otro cebador como se describe en esta memoria. La invención se refiere adicionalmente a un kit para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, comprendiendo dicho kit los cebadores de la PCR que tienen la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 13 y SEC ID nº 15, para uso en el protocolo de identificación mediante PCR de A5547-127 descrito en esta memoria. La invención se refiere también a un kit para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, kit que comprende una sonda específica que tiene una secuencia que corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica de A5547-127. Preferiblemente, la secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127. Muy preferiblemente, la sonda específica tiene (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia comprendida entre el nucleótido 260 y 360 de SEC ID nº 1, o la secuencia entre el nucleótido 460 y 560 de SEC ID nº 2. Los métodos y kits se pueden usar para diferentes fines, tales como, pero sin carácter limitante, los siguientes: identificar la presencia o ausencia de A5547-127 en plantas, material vegetal o en productos tales como, pero sin carácter limitante, productos alimentarios o piensos (nuevos o elaborados) que comprenden o derivan de material vegetal; adicional o alternativamente, los métodos y kits de la presente invención se pueden usar para identificar material vegetal transgénico con fines de segregación entre material transgénico y no transgénico; adicional o alternativamente, los métodos... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, método el cual comprende detectar una región de ADN específica de A5547-127 que comprende una parte de la región de ADN flanqueante de 5 o 3 del suceso élite A5547-127 y una parte de la región de ADN extraño del suceso élite A5547-127 contigua con ella, con un cebador o sonda, en el que dicha región de ADN flanqueante de 5 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, dicha región de ADN extraño contigua a dicha región flanqueante de 5 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810, dicha región de ADN flanqueante de 3 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, y dicha región de ADN extraño contigua a dicha región flanqueante de 3 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509. 2. El método de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método amplificar un fragmento de ADN de entre 100 y 500 pb a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, reconociendo uno de dichos cebadores la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, teniendo dicha región flanqueante de 5 la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, y teniendo dicha región flanqueante de 3 la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, reconociendo el otro cebador de dichos cebadores una secuencia en el ADN extraño que tiene la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810, o la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509, respectivamente. 3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante de 5 consiste en una secuencia nucleotídica de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, o dicho cebador que reconoce la región flanqueante de 3 de A5547-127 consiste en una secuencia nucleotídica de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce la secuencia en el ADN extraño consiste en 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810 o la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509, respectivamente. 4. El método de la reivindicación 2, en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante de 5 comprende en su extremo 3 terminal una secuencia nucleotídica de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, o dicho cebador que reconoce la región flanqueante de 3 de A5547-127 comprende en su extremo 3 terminal una secuencia nucleotídica de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce una secuencia en el ADN extraño comprende en su extremo 3 al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810 o la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509, respectivamente. 5. El método de la reivindicación 4, en el que dichos cebadores comprenden la secuencia de SEC ID nº 13 y SEC ID nº 15, respectivamente. 6. El método de la reivindicación 5, método el cual comprende amplificar un fragmento de alrededor de 151 pb usando el protocolo de identificación de A5547-127. 7. Un kit para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, comprendiendo dicho kit un conjunto de al menos dos cebadores como se describe en las reivindicaciones 2 a 5. 8. Un cebador para uso en un protocolo de identificación mediante PCR de A5547-127, que tiene una secuencia que, en condiciones optimizadas de PCR, reconoce específicamente una secuencia en la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, teniendo dicha región flanqueante de 5 la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, y teniendo dicha región flanqueante de 3 la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, y comprendiendo dicho cebador en su extremo 3 terminal una secuencia nucleotídica de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de dicha región flanqueante de 5 o el complemento de dicha región flanqueante de 3. 9. El cebador de la reivindicación 8, en el que dicho cebador consiste en una secuencia nucleotídica de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311 o del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880. 10. El cebador de la reivindicación 8, en el que dicho cebador comprende en su extremo 3 terminal una secuencia nucleotídica de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311 o del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el 38   nucleótido 1880. 11. Un cebador que comprende en su extremo 3 terminal la secuencia de SEC ID nº 13. 12. Un cebador que comprende en su extremo 3 terminal la secuencia de SEC ID nº 15. 13. El método de la reivindicación 1, método el cual comprende hibridar un ácido nucleico de muestras biológicas con dicha sonda que reconoce además específicamente el ADN extraño contiguo a la región de ADN flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, en el que dicha región de ADN extraño comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810, o de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509. 14. El método de la reivindicación 13, en el que la sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con dicha región de ADN específica de A5547-127, o su complemento. 15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en el que la sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID nº 1 desde el nucleótido 260 hasta 360, o con SEC ID nº 2 desde el nucleótido 460 hasta 560, o el complemento de dichas secuencias. 16. Un kit para identificar el suceso élite A5547-127 en muestras biológicas, comprendiendo dicho kit una sonda como se describe en la reivindicación 13 a 15, en el que dicha sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la región de ADN específica de A5547-127 de la reivindicación 1. 17. Una sonda para la identificación del suceso élite A5547-127 en muestras biológicas mediante hibridación de una región de ADN específica de A5547-127 como se describe en la reivindicación 1, en la que dicha sonda tiene una secuencia que reconoce dicha región de ADN específica de A5547-127 que comprende parte de la región flanqueante de 5 o 3 de A5547-127 y parte del ADN extraño contiguo a ella, en la que dicha región de ADN flanqueante de 5 tiene una secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, dicha región de ADN flanqueante de 3 tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, y dicha región de ADN extraño tiene una secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810 o la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509, respectivamente, en la que dicha sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con dicha región de ADN específica. 18. La sonda de la reivindicación 17, que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID nº 1 desde el nucleótido 260 hasta 360, o con SEC ID nº 2 desde el nucleótido 460 hasta 560, o el complemento de dichas secuencias. 19. Una sonda para uso en la hibridación de una región de ADN específica de A5547-127 como se describe en la reivindicación 1, cuya secuencia tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID nº 1 desde el nucleótido 260 hasta 360, o con SEC ID nº 2 desde el nucleótido 460 hasta 560, o el complemento de dichas secuencias. 20. Un método para confirmar la pureza de las semillas, método el cual comprende la detección de una región de ADN específica de A5547-127 que comprende una parte de la región de ADN flanqueante de 5 o 3 del suceso élite A5547-127 y una parte de la región de ADN extraño del suceso élite A5547-127 contigua a ella, con un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de ADN flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, en muestras de semillas, en el que dicha región de ADN flanqueante de 5 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311 contigua a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810 del ADN extraño, y en el que dicha región de ADN flanqueante de 3 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880 contigua a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509 del ADN extraño. 21. Un método para identificar semillas en busca de la presencia de A5547-127, método el cual comprende la detección de una región de ADN específica de A5547-127 que comprende una parte de la región de ADN flanqueante de 5 o 3 del suceso élite A5547-127 y una parte de la región de ADN extraño del suceso élite A5547- 127 contigua a ella, con un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de ADN flanqueante de 5 o 3 de A5547-127, en muestras de lotes de semillas, en el que dicha región de ADN flanqueante de 5 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311 contigua a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810 del ADN extraño, y en el que dicha región de ADN flanqueante de 3 comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880 contigua a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509 del ADN extraño. 22. Un amplicón discriminante que identifica específicamente el suceso élite A5547-127 de haba de soja, amplicón el cual se puede obtener a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende dicho suceso élite usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, reconociendo uno de dichos cebadores la región flanqueante de 5 de A5547-127, teniendo dicha región flanqueante de 5 la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 39   desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 311, o la región flanqueante de 3 de A5547-127, teniendo dicha región flanqueante de 3 la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 510 hasta el nucleótido 1880, reconociendo el otro cebador de dichos cebadores una secuencia en el ADN extraño que tiene la secuencia nucleotídica del complemento de SEC ID nº 1 desde el nucleótido 312 hasta el nucleótido 810, o la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 509, respectivamente.   41   42