Enzimas lisantes de la pared celular estables frente a proteasas.

Variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº:

1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13.

Enzimas lisantes de la pared celular estables frente a proteasas La presente invención se refiere a una variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13. La invención se refiere además a ácidos nucleicos con una secuencia que codifica para los polipéptidos de acuerdo con la invención.

Las bacterias patógenas aparecen en muchos sitios y provocan enormes problemas de salud por infecciones así como altos costes económicos por ejemplo también por ataque bacteriano indeseado en la industria alimentaria, cosmética o medioambiental. En la Sanidad, crecen cada vez más los problemas debidos a gérmenes resistentes a antibióticos, de modo que se buscan desesperadamente alternativas a los antibióticos. En la industria alimentaria y cosmética se intenta cada vez más defenderse sin los conservantes clásicos, que encuentran en la población cada vez menos aceptación. Como solución para estos problemas se ofrece el uso de enzimas lisantes de la pared celular, que suprimen de manera natural el crecimiento de las bacterias indeseadas y destruyen los gérmenes existentes.

Ejemplos de enzimas lisantes de la pared celular son endolisinas que se aislaron a partir de bacteriófagos. Los bacteriófagos utilizan estas enzimas al final de su ciclo de reproducción, para liberar los bacteriófagos formados dentro de la célula bacteriana. La envoltura bacteriana se lisa a este respecto y de esta manera se destruye la bacteria huésped. Un ejemplo adicional son enzimas que necesitan el bacteriófago al principio de su ciclo de reproducción y por regla general están localizadas en proteínas de cola de bacteriófago. Estas enzimas se necesitan para la rotura de la pared bacteriana en el caso de la infección bacteriana. Un tercer ejemplo son enzimas que presentan una función similar y con frecuencia también una similitud secuencial con respecto a las endolisinas. Estas enzimas son las autolisinas formadas por bacterias en determinadas circunstancias, que llevan a la autolisis de las bacterias. Un cuarto ejemplo son enzimas que se forman así mismo por bacterias y se conocen como bacteriocinas. Estos cuatro grupos de enzimas lisantes de la pared celular se utilizan ya técnicamente y probablemente en el futuro ganarán importancia.

Un campo de aplicación es el uso médico en la prevención y la terapia así como en el diagnóstico de infecciones bacterianas en el ser humano y en animales. Un campo de aplicación adicional es la aplicación en la industria alimentaria, medioambiental y cosmética para impedir un crecimiento bacteriano indeseado y para destruir los gérmenes por ejemplo mediante desinfección así como la detección de bacterias en muestras alimentarias, medioambientales y cosméticas.

Prácticamente todas las aplicaciones en las que se usan enzimas que lisan bacterias exigen altos requisitos sobre la estabilidad de las enzimas utilizadas, mereciendo la pena por lo tanto su uso económicamente. En el documento US

6.432.444 B1 se propone para la estabilización de las enzimas lisantes de la pared celular, usar por ejemplo un tampón de estabilización para garantizar la actividad enzimática óptima. Además se propone la adición de sustancias estabilizantes tales como agentes de reducción, quelantes de metal, inmunoglobulinas, sales tampón específicas, valores de pH fisiológicos, agentes conservantes o detergentes suaves.

En general la estabilidad de las proteínas se reduce con frecuencia debido a las proteasas presentes. Estrategias para el aumento de la estabilidad de proteínas frente a una degradación por proteasa son por ejemplo la adición de quelantes de metal, para inhibir las proteasas, que para su actividad necesitan iones de metal o la adición de inhibidores de proteasas especiales, tal como pueden obtenerse comercialmente por ejemplo para serina proteasas. Sin embargo, los inhibidores de proteasa pueden utilizarse para la estabilidad de enzimas lisantes de la pared celular sólo en determinados casos, porque perturban también otros componentes esenciales en el sitio de acción. Además los inhibidores específicos son también muy caros. También la elección de otras condiciones del entorno, en las que las proteasas son menos activas, no es posible por regla general, dado que las enzimas lisantes de la pared celular necesitan condiciones muy similares para su actividad que las proteasas. De este modo, las enzimas lisantes de la pared celular trabajan del mejor modo en un entorno acuoso y con valores de pH moderados, en las que la mayor es también la actividad proteasa. Los planteamientos de estabilización conocidos no son adecuados para el uso en el caso de enzimas lisantes de la pared celular.

Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar enzimas estables lisantes de la pared celular.

El objetivo se consigue mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras sirven para explicar la invención.

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de tipo natural del dominio CHAP (aminoácido 1-154) , la región de ligador (subrayado, aminoácido 155-193) y el dominio de amidasa (aminoácido 194-393) de una endolisina de PlyPitti26. Puntos de corte potenciales para proteasa V8, que corta después del resto de aminoácido E, están resaltados en negrita y se encuentran en las posiciones de aminoácido 163, 179 y 189. El sitio de escisión de trombina está marcado en gris y se encuentra en la posición R167.

La Figura 2 muestra el resultado de una digestión con proteasa y posterior prueba de actividad de PlyPitti26 no modificada con las proteasas trombina y V8 proteasa. La Figura 2A muestra un gel de SDS-poliacrilamida con muestras de PlyPitti26 no modificada después de una digestión con trombina (T) , V8 proteasa (V8) y una digestión de control con plasmina (P) , para la que no existe sitio de escisión. PlyPitti26 sin digerir está marcada con “-”. M designa patrones de peso molecular con los tamaños de proteína indicados en el borde en kDa. En el borde derecho están indicadas las posiciones de las bandas para el fragmento del extremo N terminal del sitio de escisión de trombina (dominios CHAP) , el fragmento del extremo C terminal del sitio de escisión (Ami-CBD) y las bandas de trombina añadida. La Figura 2B muestra el resultado de una prueba de lisis de líquidos para determinar las actividades específicas de PlyPitti26 no modificada digerida y no digerida. La lisis de células bacterianas se sigue mediante una medición de dispersión de la luz en el fotómetro. Están representadas las curvas de lisis para PlyPitti26 sin digerir (__) , endolisina digerida con plasmina (-----) , así como digerida con trombina (_._.) o digerida con V8 proteasa (_.._..) .

La Figura 3 muestra el resultado de una digestión con proteasa de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada y no modificada. La Figura 3A muestra el resultado de una digestión con trombina de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3) . CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada tiene un sitio de escisión de trombina singular entre el dominio CHAP y amidasa en la posición R167, el polipéptido modificado un intercambio de R con A en la posición 167. La Figura 3A muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de la digestión con trombina: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa indicados en el borde) ; 1 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada sin trombina; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada después de la digestión con trombina; 3 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin trombina; 4 -CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada después de la adición de trombina.

La Figura 3B muestra el resultado de una digestión con V8 proteasa de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3) . CHAPAmiPitti26-CBDUSA no modificada tiene un sitio de escisión de V8 proteasa entre el dominio CHAP y amidasa en la posición E163, el polipéptido modificado un intercambio de E con A en la posición 163. La Figura 3B muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de digestión con V8-proteasa: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa indicados en el borde) ; 1 - CHAPAmiPitti26-CBDUSA no modificada sin V8 proteasa; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 15 min de digestión con V8 proteasa; 3 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 60 min de digestión con V8 proteasa; 4

- CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin V8 proteasa; 5 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada 15 min de digestión... [Seguir leyendo]

1. Variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13.

2. Molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 como fármaco o como agente de diagnóstico.

6. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como fármaco para la prevención o la terapia de enfermedades provocadas por bacterias Gram positivas, en particular clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc.

7. Uso del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la supresión del crecimiento de bacterias Gram positivas en las industrias medioambiental, alimentaria o cosmética.

8. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como agente de diagnóstico en medicina e industrias medioambiental, alimentaria o cosmética.