Planta de aloe transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante,

comprendiendo dicho constructo un promotor, una secuencia que codifica para una proteína exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción;

en la que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30;

la proteína exógena se expresa a partir del constructo de ADN; y

al menos una parte de la proteína exógena se traslada desde una célula de aloe hacia el gel de una hoja de aloe de la planta de aloe transgénica

Plantas de aloe transgénicas para la producción de proteínas y métodos relacionados.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una planta de aloe transgénica, a métodos para producir en plantas de aloe proteínas biológicamente activas exógenas a dichas plantas, y a métodos de producción de plantas de aloe transgéni- cas.

Sigue habiendo un mercado en crecimiento para proteínas biológicamente activas, muchas de las cuales se usan para fines terapéuticos. En la actualidad, se encuentran disponibles más de 160 medicamentos a base de proteínas. Se espera que se aprueben más o menos cincuenta adicionales a lo largo de los dos próximos años. La demanda actual de producción de proteínas terapéuticas está ya sobrepasando la capacidad de la industria. Se ha predicho que la industria necesitará aumentar su capacidad en cuatro a cinco veces para superar este embotellamiento. Sin embargo, las instalaciones de producción para proteínas terapéuticas son caras y normalmente se tarda un largo tiempo en construir. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos de producción que sean menos caros y puedan reducir el tiempo requerido para incrementar la producción.

Se usan algunos métodos de producción de proteínas basados en animales. Sin embargo, éstos introducen frecuentemente riesgos para la salud a causa de enfermedades. Tales riesgos pueden surgir de la contaminación cruzada con enfermedades que pueden afectar tanto al animal como al usuario final tal como un paciente humano. Por consiguiente, existe una necesidad de un método de producción que elimine la posibilidad de contaminación cruzada entre el organismo de producción y el usuario final.

Además, muchos métodos de producción actuales requieren un procesamiento extenso con el fin de extraer la proteína terapéutica del animal u otro organismo huésped en el que se produjo y obtener el compuesto en un estado en el que puede utilizarse por un paciente. Tras la purificación, la proteína puede combinarse con un adyuvante u otro material vehículo para estabilizar la proteína y permitir la utilización por un paciente. Sin embargo, los procesos de extracción, purificación, resuspensión entre otros implicados con el procesamiento de una proteína terapéutica son complejos y engorrosos y pueden no ser propicios para su uso en países subdesarrollados que generalmente necesitan agentes terapéuticos. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos de producción simplificados que puedan eliminar o reducir el procesamiento tras la extracción de proteínas terapéuticas.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una planta de aloe transgénica que tiene las características según la reivindicación 1 de las reivindicaciones adjuntas.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de producción de una planta de aloe transgénica tal como se expone en la reivindicación 8 de las reivindicaciones adjuntas.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un método de producir en una planta una proteína biológicamente activa tal como se expone en la reivindicación 4 de las reivindicaciones adjuntas.

Las plantas de aloe transgénicas que producen proteínas de mamífero según la presente invención pueden proporcionar una alternativa más viable económicamente para la producción de proteínas de interés tales como por ejemplo diversas proteínas biológicamente activas y cosméticas. Las proteínas de interés se ubican y/o concentran dentro del gel de la hoja de aloe. Esta ubicación de las proteínas de interés puede simplificar la extracción de la proteína de la planta. En este aspecto, la proteína de interés puede coextraerse junto con la extracción del gel nativo dentro de la parte central de la hoja de aloe. Por consiguiente, la presente invención puede proporcionar una planta transgénica a partir de la cual las proteínas de interés se encuentran generalmente más fácilmente accesibles que las de la mayoría de plantas transgénicas tales como por ejemplo tabaco y maíz. Además, la presente invención puede proporcionar un método eficaz para aislar proteínas.

Las plantas de aloe pueden ofrecer diversas ventajas sobre los métodos convencionales para producir proteínas de interés en bacterias y levaduras. Las ventajas de las plantas 10 de aloe pueden incluir la capacidad para procesar proteínas de maneras que las bacterias y levaduras unicelulares simples son poco adecuadas y que pueden ser necesarias para producir las proteínas en la forma deseada. Este procesamiento puede incluir la modificación química, tal como mediante glicosilación, y el plegamiento de algunas proteínas, por ejemplo. Además, en comparación con otros métodos de producción de proteínas basados en células animales, la producción de plantas de aloe puede ofrecer beneficios de coste significativos, ventajas de ampliación a escala y un riesgo reducido de contaminación que puede ser perjudicial para los seres humanos.

Un gel modificado con proteínas de la parte central de la hoja de aloe de una planta de aloe transgénica según la presente invención puede usarse directamente a partir de la planta de aloe. Esto puede evitar la necesidad de extracción relativamente compleja y cara de las proteínas de interés de los materiales de la planta nativa. En algunos aspectos, el gel extraído de la hoja puede usarse directamente sin la necesidad de extracción o procesamiento de las proteínas. El gel puede estar en forma de la médula extraída mecánicamente desde un extremo abierto de una hoja rota de una planta de aloe transgénica.

La presente invención puede proporcionar alternativas viables económicamente para la producción de proteínas de seres humanos y otros mamíferos que son biológicamente activas y/o tienen aplicaciones cosméticas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un ejemplo de la anatomía en sección transversal de una hoja de aloe;

la figura 2 ilustra métodos a modo de ejemplo para generar tejido del callo;

la figura 3 resume de manera esquemática diversas etapas para generar una planta de aloe transgénica;

la figura 4 ilustra de manera esquemática los componentes de un vector plasmídico incluyendo la información de secuencia;

la figura 5 enumera la información de secuencia para el promotor de ubiquitina de maíz y destaca regiones del promotor de ubiquitina;

las figuras 6A y 6B ilustran la construcción de un sistema de vector plasmídico según aspectos de la presente invención;

las figuras 7A a 7C ilustran la construcción de otro sistema de vector plasmídico según aspectos de la presente invención;

la figura 8 ilustra la construcción de sistemas de vector plasmídico adicionales según aspectos de la presente invención; y

la figura 9 ilustra la construcción de sistemas de integración según aspectos de la presente invención.

Todas las figuras se ilustran para facilitar la explicación de las enseñanzas básicas de sólo la presente invención; las extensiones de las figuras con respecto al número, posición, secuencia, relación y composiciones de las diversas realizaciones se explicarán o estarán dentro de los conocimientos de la técnica tras la revisión de la siguiente descripción. Además, los diversos protocolos, herramientas, y composiciones para poner en práctica la invención dada a conocer estarán dentro de los conocimientos de la técnica tras la revisión de la siguiente descripción.

Descripción detallada de la invención

Tal como se usa en la memoria descriptiva, "un" o "una" puede significar uno/una o más. Tal como se usa en la(s) reivindicación/reivindicaciones, cuando se usan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno/una o más de uno/una. Tal como se usa en el presente documento "otro/otra" puede significar al menos un/una segundo/segunda o más.

Tal como se usa en el presente documento una "célula de aloe transformada" significa una célula vegetal que se transforma con ADN recombinante, no natural, integrado de manera estable, por ejemplo mediante la transformación mediada por Agrobacterium o mediante bombardeo usando micropartículas recubiertas con ADN recombinante u otros medios. Una célula de aloe transformada de esta invención puede ser una célula vegetal originalmente transformada que existe...

1. Planta de aloe transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante, comprendiendo dicho constructo un promotor, una secuencia que codifica para una proteína exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción;

en la que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30;

la proteína exógena se expresa a partir del constructo de ADN; y

al menos una parte de la proteína exógena se traslada desde una célula de aloe hacia el gel de una hoja de aloe de la planta de aloe transgénica.

2. Planta según la reivindicación 1, en la que el promotor es promotor de ubiquitina de maíz (SEQ. ID. N.º 44).

3. Planta según la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia de translocación es la secuencia secretora de alfa-amilasa (SEQ. ID. N.º 29) de arroz (Oryza sativa).

4. Método para producir en una planta una proteína biológicamente activa exógena a la planta, comprendiendo dicho método:

proporcionar una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica para la proteína exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción,

cultivar la planta de modo que se exprese la proteína exógena a partir del constructo de ADN; y

extraer la proteína de la planta

en el que la planta es aloe,

el constructo de ADN contiene un péptido señal de secreción de modo que al menos una parte de la proteína exógena se traslada hacia el gel de las hojas de aloe, y la proteína exógena se extrae en el gel de la hoja, y

la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el promotor es promotor de ubiquitina de maíz (SEQ. ID. N.º 44).

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el que la secuencia de translocación es la secuencia secretora de alfa-amilasa (SEQ. ID. N.º 29) de arroz (Oryza sativa).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que comprende la etapa de generar la planta transgénica mediante un procedimiento que comprende:

obtener células de aloe embrionarias a partir de una semilla de aloe;

hacer crecer las células de aloe en cultivo para formar un callo en un medio nutritivo que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y 6-bencilaminopurina (BAP);

transformar el callo con el constructo de ADN recombinante;

seleccionar células de aloe transformadas que contienen el constructo de ADN recombinante mientras que se hace crecer el callo en un medio de brotación y selección que comprende IAA o NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/ml;

hacer crecer en un medio de enraizamiento que comprende NAA 0,2 mg/l, un brote regenerado en el medio de brotación y selección; y

una vez que las raíces han comenzado a formarse, transferir la plántula al suelo.

8. Método de producción de una planta de aloe transgénica para producir en la planta una proteína biológicamente activa exógena a la planta, comprendiendo el método:

cultivar callo no diferenciado de células de aloe en un medio nutritivo que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y 6-bencilaminopurina (BAP);

introducir en el callo un constructo de ADN recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica para la proteína exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción;

hacer crecer el callo en un medio de brotación y selección que comprende IAA o NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/ml;

hacer crecer en un medio de enraizamiento que comprende NAA 0,2 mg/l, un brote regenerado en el medio de brotación y selección; y

una vez que las raíces han comenzado a formarse, transferir la plántula al suelo;

en el que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el callo es de semilla de aloe.

10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el que el tejido de callo se bombardea directamente con el constructo de ADN recombinante.