Péptidos inhibidores selectivos de la actividad biológica de la calcineurina.

La presente invención se encuadra en el sector de la biotecnología aplicada al área de la salud humana y más concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos, LxVPc1, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta de señalización Calcineurina (CN)-NFAT y de la actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles immunosupresores y sirven de base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva de la CN

Péptidos inhibidores selectivos de la actividad biológica de la calcineurina.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector de la biotecnología aplicada al área de la salud humana y más concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos, LxVPc1, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta de señalización Calcineurina (CN)-NFAT y de la actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles immunosupresores y sirven de base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva de la CN.

Antecedentes de la invención

La ruta Calcio/Calcineurina/NFAT desempeña un papel destacado en una gran cantidad de procesos biológicos importantes, incluyendo el desarrollo y funcionamiento de los sistemas inmune y nervioso, formación de la vasculatura, morfogénesis de las válvulas cardíacas y crecimiento y desarrollo muscular (1-5). Las señales de calcio activan a la fosfatasa calcineurina (CN), que desfosforila a los factores de transcripción NFATc1, NFATc2, NFATc3 y NFATc4 (nomenclatura HUGO). Esto induce su translocación desde el citoplasma al núcleo y aumenta su capacidad de unión al ADN, provocando la expresión génica dependiente de NFAT (6). La unión de CN a los NFATs es por lo tanto un paso esencial en la activación de esta familia de factores de transcripción.

La calcineurina, también conocida como la proteína fosfatasa 2B, es un heterodímero que consta de una subunidad catalítica (CnA) fuertemente unida a una subunidad reguladora (CnB). La CnA se compone de un dominio catalítico y otro regulador que contiene la secuencia de unión con la CnB, un dominio de unión de calmodulina (CaM) y un segmento autoinhibidor (7). La actividad fosfatasa de CnA se regula por un complejo formado por Ca²⁺, CnB y CaM; ambas proteínas reguladoras son esenciales para esta actividad (7,8). La CN puede unirse tanto a NFAT fosforilado como desfosforilado (9,10); y aunque la CN inactiva puede unirse a los NFAT, la unión es más fuerte con la CN activada (11). En los NFAT, esta interacción ha sido localizada dentro del dominio regulador N-terminal, que está conservado en los cuatro miembros (12-14). Mediante análisis mutacional se analizaron los motivos conservados dentro del dominio regulador de NFATc2, definiéndose la secuencia SPRIEIT como el sitio de anclaje de calcineurina (15). En estudios posteriores se identificaron los residuos conservados en las secuencias correspondientes de los demás miembros de NFAT, definiéndose el motivo PxIxIT (ver Fig. 1A), que parece ser funcional en todos los miembros de NFAT regulados por CN (11,16-18).

NFAT se describió por primera vez como un factor esencial para la expresión del gen de la IL-2 (19), y posteriormente se ha implicado en la regulación de muchos otros genes necesarios para una respuesta inmune eficaz (20-23). El descubrimiento de que CN es la diana intracelular de las drogas inmunosupresoras, como Ciclosporina A (CsA) y FK506 (24), resaltó aún más la importancia de NFAT en el sistema inmune así como de la ruta Ca²⁺/CN/NFAT (25-27). El empleo de estas drogas, CsA y FK506, es el método más frecuente para bloquear la ruta de señalización CN-NFAT, ya que inhiben la actividad enzimática de CN (24). Sin embargo, esta estrategia también inhibe otras rutas no relacionadas con NFAT dependientes de CN, lo que se asocia con los efectos secundarios severos que desencadena su uso clínico (28). Se ha visto mediante estudios usando péptidos inhibidores que el bloqueo específico de las interacciones proteína-proteína es terapéuticamente prometedor para el tratamiento de enfermedades donde esté implicada la ruta CN-NFAT. El péptido VIVIT, cuya secuencia está basada en el motivo PxIxIT y que posee una elevada afinidad por CN, es capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización dependiente de NFAT sin afectar al resto de vías activadas por CN (29). Sin embargo, en los últimos años se han descrito numerosas proteínas que se unen a CN que presentan, la mayoría de ellas, un motivo similar al PxIxIT dentro de la zona de interacción con CN (41). El péptido VIVIT podría por lo tanto bloquear tanto la interacción CN-NFAT como la de CN con otras proteínas. Por el contrario, el motivo LxVP - que participa en la interacción de NFAT con la CN activada - se ha descrito solamente en NFAT. Por lo tanto, el efecto bloqueante tanto in vitro como in vivo que aquí se describe muestra que el empleo de péptidos derivados de estos motivos posee un efecto inhibidor selectivo potencial en la ruta CN-NFAT, cubriendo pues, la necesidad de encontrar moléculas altamente selectivas capaces de inhibir la ruta CN-NFAT.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas (inhibidores) selectivos de la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente como inmunosupresores (además, se ha observado que son inhibidores de la actividad fosfatasa de la CN). La invención también se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden dichos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad, preferentemente, antagonista selectiva de la acción biológica de CN sobre NFAT y el uso de dichos péptidos para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. De la misma forma, se refiere a herramientas genéticas y métodos de producción de dichos péptidos.

Descripción de las Figuras

Fig. 1A.- Representación esquemática del dominio regulador NH₂-terminal y de las secuencias de interacción con CN de los diferentes NFATs. Las regiones conservadas entre los diferentes miembros de NFAT se muestran como sigue: SP-1, SP-2 y SP-3 son motivos repetitivos de serina-prolina susceptibles de fosforilación; SRR-1 y SRR-2 son regiones ricas en serina; y NLS es la secuencia de localización nuclear. Las dos regiones implicadas en la unión a CN, denominadas motivos PxIxIT y LxVP se muestran en negro, y por debajo se muestran las secuencias correspondientes a estos motivos en cada uno de los cuatro miembros de NFAT humano; los aminoácidos conservados entre los diferentes miembros se muestran en negrita. Los residuos indicados se sustituyeron por alaninas para producir el correspondiente péptido LxVPc1 mutante. Las abreviaturas empleadas para los diferentes motivos PxIxIT y LxVP se muestran a la derecha. Fig. 1B.- Secuencias de aminoácidos de los péptidos usados como control positivo (VIVIT) o negativo (SCRAMBLED) de competición para los experimentos de unión in vitro.

Fig. 2.- Comparación de la unión de CN a NFATc1 y NFATc2 in vitro. Fig. 2A.- La unión de NFATc1 y NFATc2 a CN es dependiente de la concentración de NFAT. Se ensayó una concentración fija de CN (20 nM) frente a concentraciones decrecientes de los dominios reguladores de NFATc2 o NFATc1 fusionados a GST (Glutathione-S-Transferase) en ensayos de pull-down. La CN unida se mostró mediante western blot usando un anticuerpo monoclonal frente a CnA. Debido a las altas cantidades de CN unida a NFATc1 se muestran dos exposiciones diferentes (panel superior e inferior respectivamente) para mostrar claramente la interacción NFATc1-CN. Se cuantificó la CN unida mediante densitometría, dato mostrado en el gráfico inferior como unidades de intensidad relativa de CN unida a cada concentración de NFAT. Fig 2B.- La unión de CN-NFAT es dependiente de la concentración de CN. Se ensayaron cantidades fijas de GST-NFATc2 (izquierda) ó GST-NFATc1 (derecha) con concentraciones decrecientes de CN (20, 10, 5 y 2,5 nM de CN). La CN se detectó usando un anticuerpo monoclonal frente a CnA: la CN unida se muestra en el panel superior; y en el inferior se muestra la CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. La tinción de las membranas de western blot con Ponceau Red confirmó que se usaron las mismas cantidades de las proteínas de fusión de GST en las reacciones (panel intermedio).

Fig. 3.- Análisis...

1. Secuencia de aminoácidos, para inhibir selectivamente la ruta de señalización de la Calcineurina (CN) sobre los factores de transcripción NFAT (CN-NFAT), que comprende la secuencia de aminoácidos

R₁-L-R₂-V-P-R₃,

donde R₁ es un aminoácido aromático del tipo Tirosina o Fenilalanina; R₂ es un aminoácido del tipo Alanina o Serina y R₃ no es el aminoácido Prolina.

2. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1, donde dichos factores de transcripción son, al menos, NFATc1 y NFATc2.

3. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo:

a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18,

b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),

c) secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).

4. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo:

a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21,

b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),

c) secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).

5. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo:

a) secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22,

b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),

c) secuencia de aá que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).

6. Secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6, donde dicha secuencia está seleccionada de uno de los siguientes grupos:

a) secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia de nucleótidos complementaria SEQ ID NO 6,

b) secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21,

c) secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22,

d) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia (a), o (b) o (c),

e) secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de (a), (b), (c) y (d).

8. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7, donde dicha secuencia es la SEQ ID NO 5 y/o la SEQ ID NO 6.

9. Construcción genética caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

10. Construcción genética según la reivindicación 9 que además comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o la detección del péptido expresado.

11. Vector de expresión génica que comprenda una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6-8 o la construcción génica según las reivindicaciones 9-10.

12. Vector de expresión génica según la reivindicación 11, donde dicho vector es un plásmido.

13. Célula transformada que contiene una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, la construcción génica según las reivindicaciones 9-10 o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11-12.

14. Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos capaces de inhibir la acción biológica de la Calcineurina sobre los factores de transcripción NFATc1 y NFATc2, que comprende el uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, la construcción génica según las reivindicaciones 9-10, el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11-12 o la célula transformada según la reivindicación 13.

15. Procedimiento de identificación de nuevos compuestos según la reivindicación 14, caracterizado porque dichos compuestos son antagonistas selectivos de la actividad biológica de Calcineurina A.

16. Procedimiento de identificación de nuevos compuestos según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho procedimiento es un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas.

17. Uso de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de enfermedades que cursen con activación de la Calcineurina.

18. Uso de los péptidos según la reivindicación 17, donde dicha enfermedad cursa con activación de linfocitos T y pertenece al siguiente grupo: enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes.