Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID n.º 1

Péptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moléculas del antígeno de leucocito humano (HLA) de clase II.

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal y de colon. La presente invención se refiere, además, a epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente invención se refiere a una secuencia peptídica novedosa derivada de moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas, que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales.

Antecedentes de la invención

La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune.

Determinados elementos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos de poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre periférica sugiere que estos linfocitos desempeñan una función importante en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col, "Annals N.Y. Acad. Sci." 1993 690: 101-112). En particular, desempeñan una función importante en esta respuesta los linfocitos T CD8⁺ (TCD8⁺), los cuales reconocen péptidos que alojan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que, en general, contienen entre 8 y 10 residuos y que derivan de proteínas ubicadas en el citosol. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células con un núcleo con péptidos resultantes de la división proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células especializadas presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y procesadas posteriormente. Los complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8⁺. Los complejos de péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4⁺.

Los linfocitos T colaboradores CD4⁺ desempeñan un papel importante en la organización de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta razón, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4⁺ derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) puede ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunes antitumorales (Kobayashi H, R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta y E. Celis; 2002; Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen; "Clin. Cancer Res"; 8: 3219-3225. Gnjatic, S, D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth y L. J. Old; 2003; Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses; "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A"; 100 (15): 8862-7).

En muestras de mamíferos como, por ejemplo, ratones, se mostró que, incluso en ausencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores (es decir, de linfocitos T CD8⁺), los linfocitos T CD4⁺ son suficientes para inhibir la visualización de tumores mediante la inhibición de la angiogénesis por secreción de interferón-gamma (IFN?) (Qin, Z. y T. Blankenstein; 2000; CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells; "Immunity"; 12: 677-686). Adicionalmente, se mostró que los linfocitos T CD4⁺ que reconocen péptidos de antígenos asociados a tumores presentados por moléculas HLA de clase II pueden contrarrestar la progresión del tumor por medio de la inducción de un anticuerpo (Ac) (Kennedy, R. C, M. H. Shearer, A. M. Watts y R. K. Bright; 2003; CD4⁺ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. "Cancer Res." 63: 1040-1045). A diferencia de los péptidos asociados a tumores unidos a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se ha descrito un pequeño número de ligandos de TAA de clase II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Debido a que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II normalmente está limitada a células del sistema inmune (Mach, B, V. Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996; Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease; "Annu. Rev. Immunol."; 14: 301-331), no se consideró posible el aislamiento de péptidos de clase II directamente de tumores primarios. Por lo tanto, se han descrito numerosas estrategias para dirigir antígenos a la vía de procesamiento de clase II de las células presentadoras de antígenos (APC). Por ejemplo, la incubación de APC con el antígeno en cuestión para permitir que sea absorbido, procesado y presentado (Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P. van der Bruggen; 1999; Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes; "J. Exp. Med."; 189: 767-778); o la transfección de células con genes o minigenes codificantes del antígeno en cuestión y fusionados con la cadena invariante, que media en el traslado de antígenos al compartimento lisosomal de procesamiento y unión del MHC de clase II (MIIC).

Para que un péptido desencadene una respuesta inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados en su secuencia, que interaccionan con el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.

En ausencia de inflamación, la expresión de moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a células del sistema inmune, especialmente a células especializadas presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos o células dendríticas.

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier tipo de proteína como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los antígenos asociados a tumores, por ejemplo, pueden estar presentes sólo en células tumorales, como productos de genes mutados o a partir de marcos de lectura abiertos (ORF) alternativos o del empalme de proteínas (Vigneron, N, V. Stroobant, J. Chapiro, A, Ooms, G. Degiovanni, S. Morel, P. van der Bruggen, T. Boon, B. J. van den Eynde; An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome; "Science"; 23 de abr. 2004; 304 (5670): 587-90). Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso), que son expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano del testículo.

Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos "antígenos específicos de tumor", son específicos de tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos, como el bcr/abl, en el linfoma. Sin embargo, muchos...

1. Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID n.º 1.

2. Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la secuencia SEQ ID n.º 1, en donde uno o dos de los residuos de aminoácido son alterados mediante el reemplazo de la cadena lateral del mismo con la cadena lateral de otro residuo natural de aminoácido, de forma que el péptido todavía es capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que el mencionado péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 1.

3. El péptido asociado a tumor conforme a la reivindicación 1, donde el péptido consta de la secuencia de aminoácidos SQDDIKGIQKLYGKRS conforme a la SEQ ID n.º 1.

4. El péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el mencionado péptido incluye enlaces no peptídicos.

5. El péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el péptido es una proteína de fusión que comprende en particular aminoácidos N-terminal de la cadena invariante (Ii) asociada a un antígeno HLA-DR.

6. Un ácido nucleico constituido por una secuencia que codifica un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El ácido nucleico conforme a la reivindicación 6 que es ADN, ADNc, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos.

8. Un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7.

9. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8.

10. La célula huésped conforme a la reivindicación 9 que es un RCC recombinante o una célula Awells.

11. Un método de producción de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, método que comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la reivindicación 9 ó 10, y de aislamiento del péptido de la célula huésped mencionada o de su medio de cultivo.

12. Una composición farmacéutica que comprende un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8, y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 12 que comprende al menos un péptido adicional asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende al menos una secuencia conforme a las secuencias SEQ ID n.º 2 a SEQ ID n.º 49.

14. La composición farmacéutica conforme a las reivindicaciones 12 o 13 en la forma de una vacuna contra el cáncer, que opcionalmente comprende al menos un adyuvante apropiado.

15. Un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 o 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8 para su uso en medicina.

16. El uso de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8 en la fabricación de un medicamento para destruir células de cáncer en un paciente donde las células de cáncer expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

17. El uso de un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8 para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune celular y, más particularmente, una respuesta inmune mediada por linfocitos T contra células de tumores sólidos donde las células expresan una molécula MHC humana de clase II en su superficie y presentan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como las dadas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

18. Un método in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, método que comprende el contacto de los CTL in vitro con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar los mencionados CTL en forma específica de antígeno, donde el antígeno mencionado es un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

19. El método conforme a la reivindicación 18, donde el antígeno se carga en moléculas MHC de clase II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada mediante el contacto de una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

20. El método conforme a la reivindicación 18, donde la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión conforme a la reivindicación 8.

21. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde la molécula MHC de clase II es HLA-DRB1*0101.

22. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos mediante el método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que reconocen de forma selectiva una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

23. Un receptor de linfocitos T (TCR) que reconoce una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, pudiéndose obtener el TCR del linfocito T citotóxico (CTL) de la reivindicación 22.

24. Un ácido nucleico que codifica un receptor de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 23.

25. Un vector de expresión capaz de expresar un receptor de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 23.

26. El uso de linfocitos T citotóxicos tal y como se definió en la reivindicación 22 en la fabricación de un medicamento para destruir células de cáncer en un paciente cuyas células de cáncer expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.