METODO DE PUNTUACION PARA DETERMINAR LA APTITUD DEL PANCREAS PARA EL AISLAMIENTO DE ISLOTES.
Un método para determinar si un páncreas aislado será una fuente de islotes terapéuticamente útiles,
que comprende:
(i) determinar el tiempo de isquemia caliente de dicho páncreas aislado y al menos dos de:
(ii) determinar el color de dicho páncreas aislado,
(iii) determinar el contenido de grasa de dicho páncreas aislado,
(iv) determinar la demarcación de islotes en dicho páncreas, y
(v) determinar el tamaño promedio de islotes en dicho páncreas antes del aislamiento de éste:
(a) en (i) a un tiempo de isquemia caliente de menos de aproximadamente 15 minutos se le asigna una puntuación de +1, y uno mayor que aproximadamente quince minutos se le asigna una puntuación de -1;
(b) a una relación de reflectancia para dicho color por encima de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de +1, y una por debajo de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de -1;
(c) a un contenido de grasa por debajo de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de +1, y por encima de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de -1;
(d) a una demarcación por encima de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de +1, y por debajo de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de -1, y
(e) a un diámetro promedio para islotes iguales o mayor que el valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de +1, y por debajo del valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de -1, en el que si, después de realizar tres de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), se obtiene una puntuación de +1 o -1, se realiza un cuarto miembro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), y si, después de realizar cuatro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v) se obtiene una puntuación de 0, se realiza el quinto miembro
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/041219.
Solicitante: THE ROGOSIN INSTITUTE.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 505 EAST 70TH STREET,NEW YORK, NY 10021.
Inventor/es: RUBIN, ALBERT L., SMITH, BARRY, GAZDA,LAWRENCE.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 30 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/50D
- G06F19/00M3E
Clasificación PCT:
- C12Q1/02 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Fragmento de la descripción:
Método de puntuación para determinar la aptitud del páncreas para el aislamiento de islotes.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos para mejorar el rendimiento de islotes en calidad y cantidad. Los islotes se encuentran en el páncreas de los animales y la invención se refiere a métodos para determinar si un páncreas dará un buen rendimiento de islotes.
Antecedentes y técnica anterior
Actualmente se ha establecido que la terapia de reemplazo de islotes es un enfoque viable para el tratamiento de pacientes con diversos trastornos. Éstos incluyen a pacientes con cáncer que se someten a una exenteración abdominal superior (Tzakis, et al., Lancet, 336: 402-405 (1990)); pancreatitis (Clayton, et al., Trasplantation, 76: 92-98 (2003); Farney, et al., Surgery. 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proc. 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation, 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes, 50: 47-50 (2001)) y pacientes dependientes de insulina, para los que el transplante de islotes es una opción terapéutica (Goss, et al., Transplantation, 74: 1761-1766 (2002); Ricordi, et al., Transplantation, 75: 1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes. 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al., N. Engl. J. Med. 343:230-238 (2000)).
Debido a la utilidad de los islotes en terapia, según se indica, supra, hay, por supuesto interés en el desarrollo de modos para aislarlos. Mientras que hay muchas publicaciones sobre el aislamiento de islotes usando métodos automatizados (Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endocrinol Diabetes. 103 Supl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation, 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant, 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Comp. Med. 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunnol. 62: 73 9-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant 9: 297-305 (2000); Wennberg, et al., Transplant. Proc. 33: 2537 (2001)), el aislamiento de islotes aún es bastante difícil. Por ejemplo, Bosta, et al., J. Investig Med. 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant, 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant 6: 48-54 (2001), O'Neil, et al., Cell Transplant 10: 235-246 (2001) y White, et al., Horm. Metab. Res. 31: 579-524 (1999), todos hablan de problemas relacionados con esto.
La invención que se expone en la descripción que sigue se refiere a un método para maximizar la probabilidad del rendimiento de islotes con éxito. Se ha determinado que mediante el uso del sistema de puntuación expuesto en este documento, se puede maximizar la oportunidad de asegurar un buen rendimiento de islotes a partir de cualquier aislamiento de islotes pancreáticos dado.
En la descripción que sigue se verá cómo se lleva esto a cabo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1A muestra una micrografía de un páncreas que, usando el método de la invención, tiene una puntuación de +3 y así aprueba como un páncreas útil, y la figura 1B muestra una micrografía de uno con una puntuación de -1, que no aprueba.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Ejemplo 1
Los animales usados en los ejemplos que siguen eran crías, de unos dos años, con paridades múltiples. Los animales fueron aturdidos eléctricamente y desangrados. Las vísceras se retiraron entonces para su disección pancreática. El tiempo entre el aturdimiento eléctrico y la colocación del páncreas en Solución Salina Equilibrada de Hank ("HBSS") fría fue generalmente de 10-15 minutos. Los tiempos de isquemia fría estuvieron en el intervalo de 15-20 minutos.
Es decir en este procedimiento, se sacó el páncreas entero y luego se cortó el anillo anular alrededor de la vena porta, transversalmente en la unión entre los lóbulos derecho e izquierdo, a fin de proporcionar una sección de tejido de biopsia de aproximadamente 2-5 mm de espesor.
Las secciones de tejido sometidas a biopsia se cortaron por la mitad y se colocaron en HBSS o en solución de ditizona ("DTZ"), de acuerdo con Ricordi, et al., en Ricordi, et al., ed. Pancreatic Islet Cell Transplantation (Austin: R.G. Landes Company, 1992), 132-142.
El páncreas se colocó entonces en HBSS al cual se había añadido suero porcino ("PS") desactivado al 2% caliente, y luego se llevó a un laboratorio para el aislamiento de islotes.
Las biopsias de páncreas se evaluaron entonces para determinar si eran adecuadas para el aislamiento de islotes. Se evaluaron cinco variables. En cada caso, se asignó una puntuación de +1 ó -1 a la variable, como se explica infra.
Primero, se determinó el tiempo de isquemia caliente. Esto se define como el tiempo entre la iniciación del desangrado y la colocación del páncreas en una solución conservante fría. Si esto se llevaba a cabo en 15 minutos, o menos, se asignaba una puntuación de +1. Si transcurrían más de 15 minutos, se asignaba una puntuación de -1. Aunque un tiempo de isquemia caliente de hasta 20 minutos producirá a veces un buen rendimiento de islotes, hay posibilidades de que haya una caída después de un tiempo de isquemia caliente de 15 minutos.
Para el segundo criterio, se observó el color del páncreas. La variación en el color entre páncreas puede ser la consecuencia de varios factores. Por ejemplo, si un páncreas muestra congestión venosa, como consecuencia, p.ej, de una electrocución de animales, o de una respuesta al estrés, entonces dicho páncreas no muestra calidades que lo hagan deseable como un donante de islotes. Ambas condiciones pueden conducir a una acumulación de sangre dentro del páncreas, liberación de hemoglobina y su difusión en el espacio extracelular. A su vez, esto conduce a un cambio en el color del órgano, por lo general, marrón o morado.
El color pancreático puede observarse subjetivamente, y el experto en la técnica puede identificar un páncreas de color oscuro (que es indeseable, y marca un -1), y uno de color claro (que es deseable, y puntúa un +1); sin embargo, una prueba más objetiva usa un colorímetro que detecta el color según la proporción de luz reflejada e incidente, "proporción de reflectancia" Si es menos de aproximadamente 60, se asigna una puntuación de -1, mientras que a uno por encima de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de +1.
El tercer criterio usado para los órganos fue el contenido de grasa. Para determinar esto, se sumergió una muestra de biopsia, de aproximadamente 2x2x0,5 cm de espesor en DTZ, durante aproximadamente 5 minutos. Después de la tinción, el tejido fue visto en un microscopio de disección con un aumento de 10x. Los islotes aparecieron rojos y el tejido lipídico verde. Se eligió un campo de visión, y se estimó el tanto por ciento del área total que aparecía verde. Si el contenido de grasa total estuviera por encima de aproximadamente el 25%, al órgano se le asignaba una puntuación de -1, mientras que a un contenido de grasa de menos de aproximadamente el 25% se le asignó un +1.
Se sobrentiende, por supuesto, que otras metodologías están disponibles para determinar el contenido de grasa de un órgano y que pueden usarse todas en esta invención.
El cuarto criterio empleado fue la demarcación de los islotes. Para este parámetro, se empleó la misma metodología de observación y de tinción. Aquellos islotes que tenían diámetros mayores de 50 µm, se evaluaron según la demarcación. Es decir, si 2 o más grupos de células de islote teñidas con DTZ se proyectaban radialmente desde el centro de un islote, más allá de lo que es normalmente un borde/plano de islote externo bruscamente demarcado liso, esto causaba una pobre determinación de la demarcación. Si más del 50% de los islotes estaban bien demarcados, a este criterio le fue dado una puntuación de +1, y si estaban menos del 50%, -1.
El criterio final era el tamaño del islote, que fue determinado en términos de diámetro, con relación al diámetro promedio de islotes para las especies del animal en consideración....
Reivindicaciones:
1. Un método para determinar si un páncreas aislado será una fuente de islotes terapéuticamente útiles, que comprende:
(i) determinar el tiempo de isquemia caliente de dicho páncreas aislado y al menos dos de:
(ii) determinar el color de dicho páncreas aislado,
(iii) determinar el contenido de grasa de dicho páncreas aislado,
(iv) determinar la demarcación de islotes en dicho páncreas, y
(v) determinar el tamaño promedio de islotes en dicho páncreas antes del aislamiento de éste:
2. El método de la reivindicación 1, que comprende (i) y al menos tres de (ii)-(v).
3. El método de reivindicación 1, que comprende todos de (i) a (v).
4. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (iii).
5. El método de reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (iv).
6. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (v).
7. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iii) y (iv).
8. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iii) y (v).
9. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iv) y (v).
10. El método de la reivindicación 2, que comprende (i)-(iv).
11. El método de la reivindicación 2, que comprende (i), (ii), (iii) y (v).
12. El método de la reivindicación 2, que comprende (i), (ii), (iv) y (v).
13. El método de la reivindicación 2, que comprende (i) y (iii)-(v).
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