PROCEDIMIENTO IN VITRO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA FUNCIONALIDAD CARDIOVASCULAR DE CÉLULAS PROGENITORAS DE MÉDULA ÓSEA (BMP) Y/O CÉLULAS PROGENITORAS CIRCULANTES DERIVADAS DE LA SANGRE (BDP).

Procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido,

en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula a partir de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. El procedimiento puede usarse en el ámbito del diagnóstico y/o del pronóstico de enfermedades cardiovasculares, para el control de su terapia y/o para la estratificación para una terapia celular programada con células madre y/o progenitoras para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido (por ejemplo, insuficiencia cardiaca). En un aspecto adicional, la presente divulgación describe entonces un procedimiento in vitro para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas que comprende: a) extracción de una muestra de un donante mamífero, b) aislamiento de las BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula de la muestra así obtenida y c) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado. Las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio agudo, miocardiopatía isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD) u otras causas de insuficiencia cardiaca.

El fallo cardiaco post–infarto sigue siendo la causa principal de morbilidad y mortalidad. Aunque una rápida reperfusión de las arterias obstruidas causa tasas de mortalidad significativamente reducidas (Lange RA, Hillis LD. “Reperfusion therapy in acute myocardial infarction”. N. Engl. J. Med. 2002: 346: 954–5), los procesos de remodelación ventricular, que se caracterizan por la expansión progresiva de la región de infarto y la dilatación de la cavidad ventricular izquierda, conducen al desarrollo de fallo cardiaco en una parte apreciable de los pacientes que sobreviven a un infarto de miocardio agudo (Pfeffer MA, Braunwald E. “Ventricular remodeling after myocardial infarction. Experimental observations and clinical implications”. Circulation. 1990: 81: 1161–72). El objetivo principal de revertir una remodelación sería la estimulación de la neovascularización así como un reforzamiento de la regeneración de miocitos cardiacos dentro de la región de infarto.

Experimentos y estudios clínicos recientes han mostrado que el transplante de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas mejoran la regeneración después de un infarto de miocardio agudo (Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi Jl, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T. “Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia”. Circulation. 2001; 103: 634–7, Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. “Neovascularization of ischemic myocardium by human bone–marrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function”. Nat. Med. 2001: 7: 430–6, Fuchs S, Baffour R, Zhou YF, Shou M, Pierre A, Tio FO, Weissman NJ, Leon MB, Epstein SE, Komowski R. “Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia”. J. Am. Coil. Cardiol. 2001; 37: 1726–32). La terapia celular con células progenitoras/madre de médula ósea es por tanto una nueva opción para la mejora de la neovascularización y de la función cardiaca en enfermedad cardiaca isquémica. Así, ha podido mostrarse efectivamente que la infusión intracoronaria de células progenitoras adultas en pacientes con infarto de miocardio agudo es practicable y segura y que está asociada a mejoras significativas de la función VI (ventricular izquierda) regional y global. Las circunstancias exactas de la mejora por la infusión permanecen sin embargo dudosas. Para una terapia celular selectiva y eficaz con células progenitoras/madre de médula ósea es además necesario asegurar que se transplantan células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) que presenten una capacidad de regeneración lo más alta posible y por tanto eficacia.

Es por tanto objetivo de la presente invención facilitar un procedimiento mejorado para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, por ejemplo, en insuficiencia cardiaca.

La presente divulgación describe además un procedimiento seguro con el que pueden identificarse y aislarse células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) eficaces y adecuadas para la terapia celular.

Según un primer aspecto de la presente invención, se consigue un objetivo de la invención mediante un procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento según la invención comprende las siguientes etapas: a) aislamiento de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) mediante marcadores de superficie específicos de célula y b) comprobación/determinación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado.

Sorprendentemente, se ha podido encontrar ahora que existe una relación directa entre la capacidad de neovascularización y la capacidad de migración de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP). Esto posibilita el uso de un ensayo de migración como herramienta valiosa para el análisis de una muestra de un mamífero con respecto a enfermedades cardiovasculares.

Además, se ha podido encontrar sorprendentemente que las células progenitoras de médula ósea de algunos donantes y/o pacientes de infarto de miocardio presentan una disfunción por la cual las células que pueden extraerse directamente de la médula ósea (BMP, por ejemplo mediante punción) están limitadas en su función de poder formar nuevos vasos y apoyar la regeneración cardiaca. Mediante el ensayo según la invención, pueden excluirse eficazmente dichos donantes. Al mismo tiempo, pueden identificarse los pacientes que, debido a una capacidad migratoria reducida de sus BMP o BDP, presentan un riesgo elevado. Estos pacientes pueden tratarse entonces adecuada y particularmente de modo preventivo y/o auxiliar. Como alternativa, pueden identificarse también mediante este ensayo pacientes que pueden experimentar un beneficio elevado mediante una terapia con células progenitoras. Ambas de las propiedades citadas anteriormente de las BMP y/o BDP, la capacidad de migración y la capacidad de neovascularización de las células, se entienden en el ámbito de la presente invención como “funcionalidad cardiovascular”.

Vasa et al. (Vasa M. et al., Circ. Res. 6 de julio de 2001; 89(1): E1–7) describen que el número y la actividad migratoria de células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) se correlacionan de forma inversa con factores de riesgo para enfermedades arteriales coronarias (EAC). Las EPC de pacientes con enfermedades arteriales coronarias muestran perjuicios funcionales. La actividad funcional de las EPC se examina mediante la capacidad migratoria, que se determina con la ayuda de un ensayo de migración en una cámara de Boyden (migración en dirección a VEGF como “quimioatractor”). La nevovascularización...

1. Procedimiento in vitro para la estratificación de pacientes con enfermedades cardiovasculares para una terapia celular programada basada en células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) para aumentar la perfusión de tejidos isquémicos o para la regeneración de la pérdida de tejido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) aislamiento de BMP y/o BDP mediante marcadores de superficie específicos de célula a partir de una muestra, y b) comprobación de la funcionalidad cardiovascular de las BMP y/o BDP aisladas mediante un ensayo de migración adecuado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la comparación de los resultados obtenidos a partir de la muestra examinada con un valor de referencia y/o el resultado de una muestra de referencia.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra a examinar se selecciona del grupo compuesto por médula ósea, sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones del mismo.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la muestra a examinar se ha extraído mediante punción de la médula ósea.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que se añade a la sangre periférica un inhibidor de la coagulación.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el aislamiento comprende el uso de centrifugación en gradiente de densidad y/o procedimientos inmunológicos.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el marcador de superficie específico de célula para BMP se selecciona de CD34, CD45 y/o CD133, y para BDP se selecciona de VEGFR2, CD105, vWF y/o CD31.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ensayo de

migración se lleva a cabo en una cámara de Boyden o cámara de Boyden modificada.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ensayo de migración se lleva a cabo usando SDF–1 para BMP o VEGF para BDP, o P1GF o MCP–1.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por angina estable e inestable, enfermedad cardiaca coronaria estable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, síndrome cardiaco agudo, enfermedad arterial coronaria, miocardiopatía

5 isquémica crónica (MCIC), miocardiopatía dilatada (MCD), insuficiencia cardiaca u otras causas de un fallo cardiaco.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las BMP y/o BDP aisladas examinadas son autólogas de los pacientes.

12. Procedimiento in vitro para la comprobación de la funcionalidad cardiovascular de células progenitoras de médula ósea (BMP) y/o células progenitoras circulantes derivadas de la sangre (BDP) específicas a partir de una muestra de un donante mamífero, que comprende:

a) facilitar una muestra y 20 b) llevar a cabo un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que las BMP y/o BDP aisladas se modifican genéticamente de manera adicional.