Una perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente que,

cuando se restringen al estar atrapadas en dicha perla, producen un material que suprime la proliferación celular, donde dicho material se difunde a través de dicha perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa, donde ese material tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas, y donde las células restringidas y células a suprimir se originan de diferentes especies

Composiciones de células restringidas capaces de crecer rápidamente que producen materiales supresores de la proliferación y usos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la restricción de la proliferación de células en o capaces de crecer rápidamente en fase logarítmica que, cuando su proliferación se restringe físicamente en un material semipermeable biocompatible, producen cantidades normalmente no expresadas o aumentadas de un factor o factores expresados normalmente capaces de inhibir el crecimiento de otras células de proliferación rápida del mismo o diferente tipo y/u origen. Estas células restringidas son denominadas en la presente memoria como células proliferativas. Una lista no limitante de células proliferativas que pertenecen a esta categoría incluye células neoplásicas, células cancerosas, y células no cancerosas que incluyen, pero no se limitan a, células embriónicas, células madre, y células en una fase regenerativa posterior al daño tisular que incluyen hepatocitos, fibroblastos y células epiteliales. Las estructuras que son una característica de la invención pueden ser usadas como tales o para producir material tal como concentrados con un peso molecular aproximado definido, que también tienen un efecto anti-proliferativo sobre las células que proliferan rápidamente asociadas a enfermedades o condiciones tales como, por ejemplo, cáncer, o para controlar el crecimiento de células para prevenir ciertos problemas médicos que pueden aparecer a partir del crecimiento celular incontrolado, tal como la formación de cicatrices tras la operación.

Antecedentes y Técnica anterior

La encapsulación de varios materiales biológicos en materiales biológicamente compatibles, que está bien documentada en la literatura, es una técnica que ha sido usada durante algún tiempo, aunque con éxito limitado. Ejemplos del estado de la técnica son las Patentes de EE.UU. Nos. 5.227.298 (Weber et al.); 5.053.332 (Cook et al.); 4.997.443 (Tice et al.); 4.971.833 (Larsson et al.); 4.902.295 (Walthall et al.); 4.798.786 (Tice et al.); 4.673.566 (Goosen et al.); 4.647.536 (Mosbach et al.); 4.409.331 (Lim); 4.392.909 (Lim); 4.352.883 Lim); y 4.663.286 Tsang et al.). También está la Patente de EE.UU. No. 5.643.569 de Jain et al. Jain et al. discuten, con algo de detalle, la encapsulación de islotes en varios materiales biocompatibles. Los islotes producen insulina, y el uso de los materiales descritos por Jain et al. en el tratamiento de la diabetes se enseña en la misma. La Patente de EE.UU. No. 5.888.497 de Jain et al. describe perlas implantables de agarosa cubiertas de agarosa que tienen células cancerosas restringidas en las mismas las cuales producen más de un material que suprime el crecimiento de células cancerosas no restringidas que un número igual de las mismas células cancerosas no restringidas. La patente de Jain et al. discute, con algo de detalle, las aproximaciones previas que se dan en el estado de la técnica en la terapia de transplante. Estas se enumeran en la presente memoria.

Se conocen cinco aproximaciones principales para proteger el tejido transplantado de la respuesta inmune del hospedador. Todas implican intentos de aislar el tejido transplantado del sistema inmune del hospedador. Las técnicas de inmunoaislamiento usadas hasta la fecha incluyen: cámaras de difusión extravascular, cámaras de difusión intravascular, cámaras de ultrafiltración intravascular, microencapsulación, y macroencapsulación. Hay muchos problemas asociados con métodos del estado de la técnica, que incluyen una respuesta fibrótica del hospedador al material del implante, inestabilidad del material del implante, difusión limitada de nutrientes a través de membranas semipermeables, permeabilidad de secretagogos y producto, y retraso en la difusión a través de barreras de membranas semipermeables.

Por ejemplo, un procedimiento de microencapsulación para rodear células, tejidos y otras membranas lábiles viables dentro de una membrana semipermeable se desarrolló por Lim en 1978. (Lim, Research report to Damon Corporation (1978)). Lim usó microcápsulas de alginato y poli L-lisina para encapsular islotes de Langerhans (denominados a partir de ahora como islotes). En 1980, se describió la primera aplicación exitosa in vivo para esta nueva técnica en la investigación de la diabetes (Lim et al., Science 210: 908 (1980)). La implantación de estos islotes microencapsulados dio como resultado un estado euglucémico sostenido en animales diabéticos. Otros investigadores, sin embargo, que repitieron estos experimentos, encontraron que el alginato causa una reacción tisular y fueron incapaces de reproducir los resultados de Lim et al. (Lamberti et al. Applied Biochemistry an Biotechnology 10 : 101 (1984); Dupuy et al. J. Biomed. Material and Res 22: 1061 (1988); Weber et al., Transplantation 49: 396 (1990); y Doon-shiong et al., Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). La solubilidad acuosa de estos polímeros ahora se considera como la responsable de la estabilidad y la biocompatibilidad limitada de estas microcápsulas in vivo (Dupuy et al., más arriba, Weber et al., más arriba, Doon-shiong et al., más arriba, y Smidsrod, Faraday Discusión of Chemical Society 57: 263 (1974)).

Iwata et al., (Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)). Utilizaron agarosa para la microencapsulación de islotes pancreáticos alogénicos y descubrieron que podía ser usada como medio para la preparación de microperlas. En su estudio, se microencapsularon de forma individual 1500-2000 islotes en agarosa al 5% y se implantaron dentro de ratones diabéticos inducidos con estreptozocina. El injerto sobrevivió durante un largo periodo de tiempo, y los receptores mantuvieron la normoglicemia de forma indefinida.

Sin embargo, su método tiene varios inconvenientes. Es torpe e inexacto. Por ejemplo, muchas perlas permanecen parcialmente cubiertas y algunos cientos de perlas en forma vacía de agarosa. Por ello, se necesita tiempo adicional para separar los islotes encapsulados de las perlas vacías. Además, muchas de las microperlas implantadas se reúnen en la cavidad pélvica, y se necesita un gran número de islotes en perlas individuales completamente cubiertas para lograr normoglicemia. Además, Las perlas transplantadas son difíciles de recuperar, tienden a ser frágiles, y liberan islotes fácilmente en daños leves.

También se ha ensayado un procedimiento de macroencapsulación. Se hicieron macrocápsulas de varios materiales diferentes, tales como poli-2-hidroxietil-metacrilato, ácido de polivinilcloruro-c-acrílico, y acetato de celulosa para el inmunoaislamiento de islotes. (Véase Altman et al., Diabetes 35 : 625 (1986); Altman et al., Transplantation : American Society of Artificial Internal Organs 30 : 382 (1984); Ronel et al., Jour. Biomedical Material Research 17 : 855 (1983); Klomp et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865-871 (1983)). En estos estudios, sólo se logró una normalización transitoria de la glicemia.

Archer et al., Journal of Surgical Research 28 : 77 (1980), usaron fibras huecas de co-polímero acrílico para evitar de forma temporal el rechazo de xenotransplantes de islotes. Describieron supervivencia a largo plazo de injertos pancreáticos dispersados de múrido neonatal en fibras huecas fueron transplantadas dentro de hámsteres diabéticos. Recientemente, Lacr et al., Science 254 : 1782-1784 (1991) confirmaron sus resultados, pero encontraron que el estado euglucémico era una fase transitoria. Encontraron que cuando los islotes se inyectan dentro de la fibra, se agregan dentro del tubo hueco con la resultante necrosis en la porción central de las masas de islotes. La necrosis central excluía la prolongación del injerto. Para resolver este problema, usaron alginato para dispersar los islotes en la fibra. Sin embargo, este experimento no se ha repetido de forma intensa. Por ello, la función de la membrana como un medio de transplante de islotes en seres humanos es cuestionable.

La patente de Jain et al discutida más arriba describe que encapsular células secretoras en un material de gel hidrofílico permeable da como resultado un material funcional no inmunogénico, que puede ser transplantado dentro de animales, se puede almacenar durante largos periodos de tiempo, y es terapéuticamente útil in vivo. La macroencapsulación de las células secretoras proporcionó...

1. Una perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente que, cuando se restringen al estar atrapadas en dicha perla, producen un material que suprime la proliferación celular, donde dicho material se difunde a través de dicha perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa, donde ese material tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas, y donde las células restringidas y células a suprimir se originan de diferentes especies.

2. La perla de la reivindicación 1 que comprende alginato-poli-(L-lisina); alginato-poli-(L-lisina)-alginato; alginato-poli-(L-lisina)-polietilenimina; quitosán-alginato; polimetacrilato de hidroxietilo-meracrilato de metilo; carbonilmetilcelulosa; K-carragenano; quitosán; agarosa-polietersulfona-hexadimetrina-bromuro (Polibreno); etilcelulosa; geles de sílice; y combinaciones de los mismos.

3. La perla según la reivindicación 1 o 2, donde dicha célula que prolifera rápidamente es seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de coriocarcinoma, una célula neoplásica o una célula madre no humana.

4. La perla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende de 120.000 a 240.000 células, o de 60.000 a 90.000 células.

5. Una composición producida por cultivo de células, restringidas en perlas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo apropiado, por recuperación del medio resultante, y por formación de un concentrado del medio por separación de la fracción que tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

6. La composición de la reivindicación 5, donde cada una de dichas perlas contiene de 10.000 a 500.000 células cancerosas, preferiblemente de 30.000 a 250.000 células cancerosas.

7. La composición de las reivindicaciones 5 o 6, donde dichas células cancerosas con células cancerosas humanas o células cancerosas de ratón.

8. Método para producir una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende:

(a) suspender células que proliferan rápidamente en una solución de agarosa,

(b) formar una perla semi-sólida suave a partir de dichas células que proliferan rápidamente suspendidas de la etapa (a),

(c) incubar dicha perla semi-sólida de la etapa (b) mientras se forma una perla sólida.

(d) Cubrir dicha perla sólida de la etapa (c) con agarosa para obtener una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente.

donde dichas células que proliferan rápidamente son definidas como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

9. Método de la reivindicación 8, donde la etapa (a) comprende añadir una solución al 1% de agarosa de baja viscosidad a las células que proliferan rápidamente y/o la etapa (d) comprende hacer rodar dicha perla sólida de la etapa (c) en agarosa al 5%, y/o poner en contacto dicha perla sólida enrollada con aceite mineral, y/o lavar dicha perla enrollada para obtener dicha perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde dicha célula que prolifera rápidamente es seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de coriocarcinoma, una célula neoplásica o una célula madre no humana.

11. Uso de una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en un individuo con necesidad del mismo, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

12. Uso de una cantidad suficiente de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en un individuo.

13. Uso según las reivindicaciones 11 o 12, donde dicho individuo es un ser humano.

14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la enfermedad hiperproliferativa es cáncer.

15. El uso según la reivindicación 11 y 14, donde dichas células que proliferan rápidamente son células cancerosas.

16. Uso según la reivindicación 15, donde dichas células cancerosas son células humanas, células de ratón u otras células no humanas.

17. Uso según las reivindicaciones 15 o 16, donde dichas células son del mismo tipo que el cáncer del que el individuo está aquejado.

18. Uso según las reivindicaciones 15 o 16, donde dichas células son de un tipo diferente de cáncer del que el individuo está aquejado.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde dichas células son células tomadas del individuo al cual es administrada dicha composición.