Procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos,

anticuerpos así obtenidos y sus aplicaciones.

La invención describe un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos sobre un soporte activado con grupos glioxil que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo opuesta al fragmento Fab del anticuerpo. Este anticuerpo inmovilizado obtenido por el procedimiento de la invención puede ser utilizado en distintos procesos biotecnológicos como por ejemplo en cromatografía de afinidad o de detección de antígenos utilizado como inmunosensor

Procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, anticuerpos así obtenidos y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La aplicación es la preparación de columnas de afinidad o inmunosensores, con posible aplicación en Biotecnologia, Biocatálisis, Fermentación, Purificación de proteínas o enzimas Biomedicina, Medio-ambiente, Deteción preventiva de toxinas, Alimentación, Control de aguas y Bioseguridad.

Estado de la técnica

La alta especificidad de los anticuerpos les ha convertido en herramientas fundamentales en procedimientos de inmunoafinidad y en el desarrollo de biosensores. No obstante, para ambas aplicaciones, los anticuerpos han de estar inmovilizados y la etapa de inmovilización puede definir las posibles aplicaciones de los anticuerpos inmovilizados (ver referencias 1-7 y 10-11).

Un sistema óptimo para inmovilizar anticuerpos para cualquiera de sus posibles aplicaciones debería de reunir una serie de requisitos, dependiendo del tipo de sistema al que se quiera aplicar:

1.- La inmovilización no debe de provocar grandes distorsiones del centro de reconocimiento del anticuerpo,

2.- La zona de reconocimiento debe de estar lo más expuesta posible al medio. Esto será clave si se pretenden utilizar en el reconocimiento de bio-macromoléculas o células, o si se pretende realizar la lectura mediante la utilización de un segundo anticuerpo o biomacromolécula, ya que sólo las moléculas cuyo centro activo estén expuestas al medio serán capaces de adsorber las macromoléculas, de forma que el porcentaje de moléculas bien orientadas determinarán la velocidad de adsorción del analito (biosensores) o la capacidad de carga de la columna,

3.- La superficie final del soporte debe de ser lo más inerte posible, para evitar adsorciones inespecificas de otras moléculas sobre el soporte, de forma que compliquen los análisis finales. En columnas de bioafinidad, la adsorción inespecífica de cualquier otro compuesto reduciría drásticamente el potencial uso de este tipo de técnicas de purificación. En el caso de biosensores, una adsorción inespecífica podrá también disminuir las posibles aplicaciones del mismo, pero se debería de conseguir especialmente que no se adsorban de forma inespecífica ninguno de los componentes implicados en la lectura de la señal (p.e., anticuerpos marcados con proteínas).

Recientemente, se ha descrito un protocolo que permite inmovilizar anticuerpos según estas características (5 y 6). El procedimiento está basado en la inmovilización del anticuerpo a través de las cadenas glicosiladas oxidadas con periodato: el anticuerpo se inmoviliza covalentemente sobre soportes aminados, que son capaces de adsorber proteínas por intercambio aniónico, y para evitarlo se procede a una etapa de bloqueo con dextrano-aspártico-aldehído, requiriéndose un control muy estricto de esta etapa para evitar la modificación química de las zonas de reconocimiento del anticuerpo. Este método permite recuperar anticuerpos con hasta un 60-70% de funcionabilidad y sin que el soporte adsorba proteínas de crudos de diferentes microorganismos. Sin embargo, el procedimiento es complejo cuando se pretende escalar a nivel industrial y complicado si se pretende recubrir el soporte de anticuerpos debido a la relativa lentitud de la reacción covalente azúcar oxidado-aminos primarios.

Descripción de la invención

Un objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, en adelante procedimiento de la invención, basado en que se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos Lys y porque comprende las siguientes etapas:

i) activación de un soporte con grupos aldehídos alifáticos, preferentemente grupos glioxil, y

ii) una reducción final de la preparación en baja concentración con un agente reductor de aldehídos o de bases schif, preferentemente con borohidruro sódico.

Otro objeto de la invención lo constituye el anticuerpo inmovilizado obtenido por el procedimiento de la invención.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del anticuerpo inmovilizado en un proceso biotecnológico perteneciente al siguiente grupo: proceso de cromatografía de afinidad o de detección de antígenos utilizado como inmunosensor, por ejemplo en mezclas con partículas en suspensión, por ejemplo, membranas o células.

Descripción detallada

La presente invención se basa en que los inventores han observado que la inmovilización covalente orientada de un anticuerpo puede llevarse a cabo sobre un soporte activado con grupos aldehido alifaticos implicando principalmente las cadenas pesadas del anticuerpo. Más concretamente, este procedimiento de inmovilización covalente orientada está caracterizado por el uso de soportes activados con grupos aldehído alifáticos tipo glioxil que dirigen la inmovilización del anticuerpo a pH alcalino.

Cada enlace individual amino-aldehído es muy débil (incluso considerando los grupos amino más reactivos) y el anticuerpo (u otra cualquier proteína) no se inmovilizan sobre estos soportes a pH neutro y sobre soportes poco activados. Únicamente cuando se usan soportes muy activados y se realiza la inmovilización a pH alcalino (muchas lisinas reactivas en la superficie de la proteína) se produce una inmovilización muy rápida e irreversible por unión covalente multipuntual entre las regiones más ricas en lisina de la proteína y estos soportes muy activados. Este método de inmovilización es único ya que no involucra los residuos amino más reactivos de la superficie de la proteína (como hacen todos los métodos de inmovilización irreversible vía grupos amino) sino que involucra únicamente la región o regiones más ricas en lisinas situadas en la superficie de las proteínas. Como puede observarse en la Figura 1, en el caso de las inmunoglobulinas, estas regiones ricas en lisina se encuentran en la proximidad de las cadenas glicosiladas en la región opuesta al fragmento Fab del anticuerpo. Es decir, la región más adecuada para una correcta inmovilización de anticuerpos el soporte.

En estas condiciones la inmovilización se produce por la región de la superficie de la proteína más rica en grupos lisina (Lys) capaces de reaccionar por su accesibilidad con una superficie plana (referencias 12 y 13) que se encuentran precisamente en la zona opuesta al centro de reconocimiento del anticuerpo. Este tipo de anticuerpos inmovilizados y orientados conservan su actividad biológica y adsorben muy rápidamente y específicamente sus correspondientes antígenos (ver Ejemplos). Tras reducir el anticuerpo inmovilizado (p.e. con borohidruro sódico), los aldehídos se transforman en inertes hidroxilos (referencia 13). Si se desea aumentar la hidrofilicidad o polaridad de la superficie del soporte, es posible incubar la preparación de anticuerpo inmovilizada (antes de reducir), con 1 M de glicina durante 1 hora y reducir la preparación posteriormente, quedando así la superficie del soporte, recubierta de estos aminoácidos, inerte para la adsorción inespecífica de cualquier otro tipo de proteínas (albúmina, inmunoglobulinas, extractos crudos de Escherichia coli, etc.). De esta forma estas superficies son tanto química como físicamente inertes, con los que ninguna proteína, por ejemplo, de E. coli. o suero bovino se adsorbe a las mismas en incubación a pH neutro y moderada fuerza fónica (10-100 mM fosfato sódico).

Este procedimiento de inmovilización se puede llevar a cabo sobre todo tipo de soportes sólidos pre-existentes y para todo tipo de aplicaciones de anticuerpos inmovilizados. Por un lado, la inmovilización de anticuerpos sobre geles de agarosa es útil para la preparación de soportes de inmunoafinidad para la adsorción selectiva de enzimas y proteínas. Por otro lado, la inmovilización de anticuerpos sobre partículas magnéticas sería muy útil para la detección de trazas de células, proteínas y cualquier analitos de interés presentes en mezclas complejas (sangre, alimentos, aguas residuales, etc.).

Así, un objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, en adelante procedimiento de la invención, basado en que se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos Lys y porque comprende las siguientes etapas:

i)...

1. Procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos caracterizado porque se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirige la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos lisina y porque comprende las siguientes etapas:

i) activación de un soporte con grupos aldehídos alifáticos, y

ii) una reducción final de la preparación en baja concentración con un agente reductor de aldehídos o de bases schif.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el grupo aldehído alifático de i) es un grupo glioxil.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque, opcionalmente y para el caso que la superficie del soporte de i) sea hidrofóbica, comprende una etapa de hidrofilización de la superficie del soporte tras la etapa i) mediante la incubación del anticuerpo inmovilizado con un compuesto hidrofílico con un grupo amino primario, preferentemente con carga neta 0 a pH neutro.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el compuesto hidrofílico que se utiliza para inertizar el soporte pertenece al siguiente grupo: glicina, mezclas Lys/Asp.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el agente reductor de aldehído es borohidruro sódico.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el soporte utilizado es poroso, por ejemplo, agarosa, vidrio, silica o epoxi-acrilico, o no poroso.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque el soporte No poroso es una nanopartícula magnética no porosa.

8. Anticuerpo inmovilizado caracterizado porque se obtiene por el procedimiento según las reivindicaciones 1 a la 7.

9. Uso del anticuerpo inmovilizado según la reivindicación 8 en un procedimiento biotecnológico perteneciente al siguiente grupo: en procesos de cromatografía de afinidad y de detección de antígenos.