Sondas conjugadas y detección óptica de analitos.

Un dispositivo sensor que comprende:

- un sensor de imágenes digitales óptico semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) que comprende como su capa superior una capa de pasivación transparente;

- una caja de luz baja; y

- una matriz de sondas conjugadas unidas covalentemente con dicha capa de pasivación transparente;

donde cada sonda conjugada comprende un producto químico o biomolécula acoplado por un enlace covalente con un polisacárido ramificado.

Sondas conjugadas y detección óptica de analitos

Campo de la técnica La presente invención se refiere a sondas conjugadas y a la detección óptica de analitos. Más específicamente, la presente invención se refiere a sondas conjugadas que se usan para formar una matriz para un sensor o sistema que usa detección óptica de analitos.

Antecedentes de la invención Las biomoléculas y otros analitos se pueden detectar usando matrices o micromatrices de sondas selectivas o específicas que se unen a analitos diana. Se han desarrollado esquemas en tecnología de matrices de biosensores para disponer puntos de sondas sobre sustratos o biocircuitos. Las matrices se usan para detectar y descubrir secuencias génicas, para seleccionar y analizar moléculas candidatas a fármacos, para investigar acciones toxicológicas o farmacológicas y para otros usos. Las dianas se pueden unir a sondas de una matriz mediante diversas interacciones, incluyendo apareamiento o hibridación de bases de ácidos nucleicos, interacciones proteínaproteína, interacciones proteína-ligando, interacciones enzima-sustrato, interacciones receptor-ligando y otras reacciones químicas.

Los biosensores permiten el análisis simultáneo de un gran número de interacciones entre biomoléculas, tales como proteínas o ácidos nucleicos en un formato de micromatriz. Representan una potente herramienta en el uso de la gran cantidad de información de secuencias generada en el Proyecto del Genoma Humano, así como de la secuenciación de genomas de otros organismos.

La señal de la especie de analito generalmente es pequeña y las señales de fondo que aparecen de varias fuentes hacen que la proporción señal-ruido de la medición sea relativamente baja. La señal baja se traduce en una proporción señal-ruido baja y una detección mala de analitos. Una solución es potencial la señal procedente de los analitos para incrementar la proporción señal-ruido inherente de la detección. Aumentar la proporción señal-ruido disminuye el límite de detección de analitos, lo que posibilita observar los analitos a una concentración más baja, de modo que se abren nuevas puertas a las aplicaciones a biomoléculas.

Vo- Dinh y col., (1999) Anal. Chem. 71, 358- 363 y Vo- Dinh (1998) Sensors and Actuators B51, nº 1/2/3 divulgan la preparación de biosensores en base a los circuitos CCD o CM0S, respectivamente. Los biosensores comprenden polinucleótidos como agentes de captura, que preferentemente están inmovilizados en una membrana desechable que se coloca sobre el circuito detector. El circuito se puede reutilizar. Los documentos WO 00/43552 A, WO 99/27140 y US- B1- 6197503 son patentes/solicitudes correspondientes a biosensores similares.

Gaudin y col., (1999) J. AOAC INT. 82, 1316-1320 divulgan la preparación de un biosensor basado en resonancia sobre plasmón superficial, que comprende una superficie de oro recubierta con una capa de CM-dextrano y funcionalizado con sulfametazina como agente de captura.

El documento WO 00/65352 se refiere a sensores caracterizados por que un circuito está recubierto con u polímero poliiónico. La superficie del circuito modificado se puede usar para inmovilizar las moléculas de captura.

Los documentos WO 98/20019 y WO98/20020 se refieren a composiciones y procedimientos para la inmovilización de sondas de ácido nucleico sobre soportes sólidos, tales como perlas de dextrano. Las perlas se pueden inmovilizar sobre una superficie para usar en la detección, aislamiento y análisis de analitos.

El documento EP- A- 0967217 divulga procedimientos para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y péptidos que se caracterizan por que se usa un 1, 3-diol que comprende un ligador. Yang y col., (1998) BBA- Gen. Subj. 1380, 329- 335 divulgan un conjugado que comprende doxorubicina y dextranos poliméricos. El documento US-A4801688 divulga conjugados entre IgG y glicoproteínas oxidadas. Coyne y col., (1994) Biotechnol. Ther. 5, 137- 162 divulga conjugados entre polimixina B y dextrano. Mehvar (2000) J. Contr. Rel. 69, 1- 25 revisa el uso de dextranos como vehículos para sistemas de liberación de fármacos. El documento US- A- 5728526 se refiere a procedimientos para analizar la secuencia de un polinucleótido diana usando sondas polinucleotídicas inmovilizadas complementarias de dicha secuencia. El documento US- A- 5789555 se refiere a procedimientos para marcar ligandos con metales.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo sensor que comprende:

- un sensor óptico de imagen digital semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) que comprende como su capar superior una capa de pasivación transparente;

- un alojamiento de luz baja; y

- una matriz de sondas conjugadas unidas covalentemente a dicha capa de pasivación transparente, en la que cada sonda conjugada comprende una sustancia química o biomolécula acoplada mediante un enlace covalente a un polisacárido ramificado.

La presente invención también se refiere a un sistema biosensor que comprende,

- una estación de lectura que tiene un primer conector;

- un alojamiento portátil que comprende un dispositivo sensor como se ha definido anteriormente; y

- un segundo conector para unir el alojamiento portátil al primer conector, uniendo de este modo el alojamiento portátil a la estación de lectura.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de detección de analitos que comprende poner en contacto un fluido que contiene analitos diana con un dispositivo o sistema como se ha definido anteriormente.

Breve descripción de las figuras La Fig. 1 ilustra una realización de un alojamiento de sensor de luz baja unido a una realización de una estación de lectura. La Fig. 2 ilustra una vista lateral de una realización de un alojamiento de sensor de luz baja. La Fig. 3 ilustra una realización de un sistema biosensor con sensor de imagen óptica extraíble. La Fig. 4 ilustra una realización de la detección de señales puntuales mediante sondas en matriz usando un sensor de imágenes CMOS.

Descripción detallada de la invención Una “matriz” o “micromatriz” es una matriz lineal o bidimensional o una matriz de regiones pequeñas, teniendo cada una un área definida, formadas sobre la superficie de un soporte sólido. Las regiones pequeñas pueden estar o no solapadas. La densidad de las regiones pequeñas en una micromatriz se determina mediante el número total de moléculas diana, tales como polinucleótidos, a detectar sobre la superficie de un único soporte de fase sólida. Aunque dos o más regiones pueden formar una matriz, la densidad típica de las regiones pequeñas es de al menos aproximadamente 50/cm2, a menudo de al menos aproximadamente 100/cm2, más a menudo de al menos aproximadamente 500/cm2, y en ocasiones de al menos aproximadamente 1, 000%m2. Como se usa en el presente documento, una micromatriz de ADN es una matriz de cebadores oligonucleotídicos colocados sobre un circuito u otras superficies usadas para amplificar o clonar polinucleótidos diana. Dado que la posición de cada grupo concreto de cebadores en la matriz se conoce, las identidades de los polinucleótidos diana se pueden determinar en base a su unión a una posición concreta en la micromatriz.

El término “marcador” o “especie marcadora” se refiere a una composición capaz de producir una señal detectable indicativa de la presencia del polinucleótido diana en una muestra de ensayo. Marcadores adecuados incluyen radioisótopos, cromóforos nucleotídicos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, nanopartículas tales como cuantos, y restos bioluminiscentes. Como tal, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos.

Como se usa el presente documento, una “muestra biológica” se refiere a una muestra de tejido o de fluido aislado de un individuo que incluye, entre otros, por ejemplo, sangre, plasma, suero, líquido espinal, líquido linfático, secciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células (incluidas, entre otras, las células sanguíneas) , tumores, órganos y también muestras de de constituyentes de cultivos celulares in vitro.

La expresión “fuentes biológicas”, como se usa en el presente documento, se refiere a las fuentes de las que derivan los polinucléotidos diana. La fuente puede ser de cualquier forma de “muestra” como se ha descrito anteriormente, incluyendo, entre otras, células,... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo sensor que comprende:

- un sensor de imágenes digitales óptico semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) que comprende como su capa superior una capa de pasivación transparente;

- una caja de luz baja; y

- una matriz de sondas conjugadas unidas covalentemente con dicha capa de pasivación transparente;

donde cada sonda conjugada comprende un producto químico o biomolécula acoplado por un enlace covalente con un polisacárido ramificado.

2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicho polisacárido ramificado se selecciona de amilosa, amilopectina, glicógeno, dextrano, celulosa, quitina, quitosano, peptidoglicano, glicosaminoglicano y mezclas de los mismos.

3. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el producto químico o biomolécula es un oligonucleótido, un ácido péptido nucleico, una proteína o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

4. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto químico o biomolécula está acoplado con el polisacárido ramificado mediante un grupo de enlace.

5. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el grupo de enlace es un reticulador fotorreactivo o un reticulador fotorreactivo heterobifuncional.

6. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde cada sonda conjugada comprende una pluralidad de productos químicos o biomoléculas que son independientemente la misma o diferentes, y que comprende además una pluralidad de especies marcadoras que son independientemente la misma

o diferentes.

7. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde una superficie del sensor de imágenes está derivatizada con un epóxido.

8. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sensor de imágenes comprende una matriz de elementos fotosensores, y donde la región localizada de cada punto de sonda discreto en la matriz es mayor que un elemento fotosensor individual.

9. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8 donde la región localizada no corresponde uno a uno con un elemento fotosensor individual en el sensor de imágenes digitales óptico.

10. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 donde la capa de pasivación es dióxido de silicio.

11. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la caja de luz baja comprende además una apertura de entrada de fluido que tiene un septo.

12. Un sistema biosensor que comprende,

-una estación de lectura que tiene un primer conector;

-una caja portátil que comprende un dispositivo sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y

- un segundo conector para unir la caja portátil con el primer conector, uniendo de este modo la caja portátil con la estación de lectura.

13. El sistema biosensor de la reivindicación 12 donde el segundo conector es un conector lateral de placa de circuito.

14. El sistema biosensor de la reivindicación 12 o 13 donde la estación de lectura comprende un medio de circuito para inserción en caliente de la caja portátil.

15. El sistema biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 que comprende además un medio para enfriar el sensor de imágenes digitales óptico.

16. Un método para detectar analitos que comprende poner en contacto un fluido que contiene analitos diana con un dispositivo o sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

17. Un método para detectar analitos de acuerdo con la reivindicación 16 donde el método comprende aumentar el tiempo de integración de fotogramas del sensor de imágenes CMOS, integrando de este modo la señal de analito.

18. El método de la reivindicación 17 que incluye además las etapas de almacenar señal integrada y repetir la interacción a intervalos de tiempo fijos.