Reducción de unión no específica en ensayos.

Composición para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito,

en la que la composición comprende

(i) un compuesto soluble que comprende un conjugado proteína-polisacárido que comprende unidades de repetición de monosacárido y es de fórmula:**Fórmula**

en la que uno de los A es un enlace con el carbono glicosídico C1 (tal como se indica en la fórmula anterior) de otra de las unidades, n es un número entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 50.000, los otros A se seleccionan independientemente del grupo que consiste en moléculas de proteína, hidrógeno, grupos que confieren solubilidad en agua o sustituyentes que reducen la cristalinidad, y L es un enlace o un grupo de unión, y la razón de moléculas de proteína con respecto a moléculas de monosacárido está en el intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:100, y

en la que, cuando L es un grupo de unión y A es una proteína, L-A tiene la fórmula:

-CH2(CH2)mCR'-NR-proteína

en la que m es un número entero de 0 a aproximadamente 5, R y R' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior y arilo, o R y R' pueden tomarse juntos para formar un doble enlace y

(ii) reactivos para detectar dicho analito, en los que al menos uno de dichos reactivos comprende un soporte sólido que comprende un segundo polisacárido,

en la que dichos reactivos comprenden una pareja de unión específica y en la que dicha proteína no se une a ninguno de dichos reactivos ni a dicho analito.

REDUCCIÓN DE UNIÓN NO ESPECÍFICA EN ENSAYOS

Antecedentes de la invención En los campos de la medicina y la química clínica, se llevan a cabo muchos estudios y determinaciones de especies fisiológicamente reactivas tales como células, proteínas, enzimas, cofactores, ácidos nucleicos, sustratos, antígenos, anticuerpos, etc. usando conjugados que implican miembros de par de unión específica o etiquetas o similares. Se conocen diversas técnicas de ensayo que implican la unión de miembros de par de unión específica. Estas técnicas de ensayo también implican generalmente una etiqueta usada en la parte de detección del ensayo.

Se han conjugado polisacáridos, particularmente dextrano, con miembros de par de unión específica, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del miembro de par de unión específica. En algunos enfoques, un polisacárido se une a una superficie de un soporte y un miembro de par de unión específica se une al polisacárido para proporcionar una superficie recubierta con polisacárido y que tiene un miembro de par de unión específica unido a la misma. Tales soportes se emplean en ensayos para analitos. La conjugación de miembros de par de unión específica con polisacáridos aumenta la voluminosidad de estas moléculas, lo que puede potenciar su eficacia en ensayos que implican miembros de par de unión específica al interferir con la unión a miembros complementarios de par de unión específica. Adicionalmente, estos conjugados, cuando están presentes sobre una superficie, permiten la unión específica de un miembro complementario de par de unión específica a la superficie con unión no específica reducida. Los conjugados de polisacárido se emplean en numerosos tipos de ensayos, incluyendo ensayos homogéneos y heterogéneos, etc., que se realizan en muestras biológicas tales como sangre, suero, y similares.

Sin embargo, hay determinadas muestras tales como, por ejemplo, muestras de suero, que producen un resultado positivo independientemente de la presencia o ausencia de un analito en ensayos en los que se emplean los soportes recubiertos con polisacárido mencionados anteriormente. La posible explicación para este resultado es la unión no específica de componentes de la muestra a uno o más de los reactivos de ensayo, particularmente el soporte recubierto con polisacárido con miembro de par de unión específica unido. La unión no específica puede aumentar la lectura de un resultado de prueba positivo, y en algunos casos, la unión no específica puede producir una lectura positiva cuando el analito está ausente, proporcionando cualquier caso un resultado de ensayo engañoso.

Se ha sugerido un enfoque para la unión no específica de IgG a una fase sólida polimérica en un inmunoensayo de una muestra de suero. El enfoque implica la inclusión de un polímero soluble en agua en la fase líquida en la que se forma el polímero soluble en agua mediante la polimerización de monómeros que son iguales que, o que tienen aproximadamente la misma afinidad de unión inmunológica que, los monómeros del polímero en la superficie de la fase sólida. Los materiales empleados como polímero soluble en agua incluían poli (estireno-alt-ácido maleico) y poli (ácido acrílico) , que demostraron superioridad con respecto a poli (ácido metacrílico) y dextrano y varios de otros materiales.

Sigue habiendo una necesidad de agentes para bloquear la unión no específica en ensayos que implican conjugados de polisacárido unidos a un soporte.

Sumario de la invención Una realización de la presente invención es un método para reducir la unión no específica en un ensayo de unión para la determinación de un analito en una muestra en el que uno de los reactivos para realizar el ensayo de unión comprende un soporte sólido que comprende un polisacárido. El método comprende incluir en un medio de ensayo para realizar el ensayo de unión un compuesto soluble que comprende una proteína unida a un polisacárido.

Otra realización de la presente invención es un método para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra que se sospecha que contiene el analito. Se proporciona una combinación que comprende la muestra, un compuesto soluble que comprende una proteína unida a un polisacárido, y reactivos para detectar el analito. Al menos uno de los reactivos para detectar el analito es un soporte que comprende un polisacárido. La combinación se incuba en condiciones para la unión del analito a uno o más de los reactivos. La presencia y/o la cantidad de unión del analito a uno o más de los reactivos se determinan cuando la presencia y/o la cantidad de la unión están relacionadas con la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra.

Otra realización de la presente invención es una composición que comprende un polisacárido unido a una proteína, en la que la unión entre el polisacárido y la proteína tiene sustancialmente la misma estructura que la unión usada para unir los miembros de par de unión específica a la superficie de un reactivo en fase sólida de un ensayo.

La proteína-polisacárido según la presente invención es un conjugado que comprende unidades de repetición de monosacárido y es de fórmula:

** (Ver fórmula) **

en la que uno de los A es un enlace con el carbono glicosídico C1 (tal como se indica en la fórmula anterior) de otra de las unidades, n es un número entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 50.000, los otros A se seleccionan independientemente del grupo que consiste en moléculas de proteína, hidrógeno, grupos que confieren solubilidad en agua o sustituyentes que reducen la cristalinidad, y L es un enlace o un grupo de unión, y la razón de moléculas de proteína con respecto a moléculas de monosacárido está en el intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:100.

En algunas realizaciones, cuando L es un grupo de unión y A es una proteína, L-A tiene la fórmula:

- CH2 (CH2) mCR1-NR-proteína en la que m es un número entero de 0 a aproximadamente 5, R y R se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior y arilo, o R y R pueden tomarse juntos para formar un doble enlace.

Descripción de las realizaciones específicas Tal como se mencionó anteriormente, en un aspecto se proporciona un método para reducir la unión no específica en un ensayo de unión para la determinación de un analito en una muestra en el que uno de los reactivos para realizar el ensayo de unión comprende un soporte sólido que comprende un polisacárido. El método comprende incluir en un medio de ensayo para realizar el ensayo de unión un compuesto soluble que comprende una proteína unida a un polisacárido.

Unión no específica, en general, significa unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras de superficie específicas. La unión no específica se diferencia de la unión específica, que implica el reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por la otra en comparación con sustancialmente menos reconocimiento de otras moléculas. La unión no específica puede resultar de varios factores incluyendo interacciones hidrófobas entre moléculas, interacciones electrostáticas o de intercambio iónico entre moléculas, interacciones específicas de especie entre moléculas (por ejemplo, anticuerpo humano anti-ratón, anticuerpo de ratón anti-oveja, y similares) , etc. La naturaleza de la molécula o moléculas que da (n) como resultado la unión no específica en ensayos depende de la naturaleza de la muestra, del medio de ensayo, de la superficie del reactivo en fase sólida, etc. En su mayor parte, las moléculas de unión no específica son materiales proteicos tales como, por ejemplo, inmunoglobulinas no específicas, inmunoglobulinas que tienen especificidad por moléculas distintas del analito del ensayo, proteínas de la cascada del complemento, proteínas de la cascada de coagulación y similares. La muestra puede ser tejido biológico, que incluye tejido extirpado de un órgano u otra parte del cuerpo de un huésped y fluidos corporales, por ejemplo, sangre completa, plasma, suero, orina, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, y similares. En muchos casos, la muestra es plasma o suero.

El ensayo de unión implica generalmente la unión específica entre moléculas. Las moléculas pueden denominarse miembros de un par de unión específica ("sbp") , lo que significa una de dos moléculas diferentes, que tienen una zona sobre la superficie o en una cavidad, que se une específicamente a y que se define de ese modo como complementaria con una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros del... [Seguir leyendo]

1. Composición para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito, en la que la composición comprende (i) un compuesto soluble que comprende un conjugado proteína-polisacárido que comprende unidades de repetición de monosacárido y es de fórmula:

** (Ver fórmula) **

en la que uno de los A es un enlace con el carbono glicosídico C1 (tal como se indica en la fórmula anterior) de otra de las unidades, n es un número entero de aproximadamente 3 a aproximadamente 50.000, los otros A se seleccionan independientemente del grupo que consiste en moléculas de proteína, hidrógeno, grupos que confieren solubilidad en agua o sustituyentes que reducen la cristalinidad, y L es un enlace o un grupo de unión, y la razón de moléculas de proteína con respecto a moléculas de monosacárido está en el intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:100, y en la que, cuando L es un grupo de unión y A es una proteína, L-A tiene la fórmula:

-CH2 (CH2) mCR-NR-proteína en la que m es un número entero de 0 a aproximadamente 5, R y R se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior y arilo, o R y R pueden tomarse juntos para formar un doble enlace y

(ii) reactivos para detectar dicho analito, en los que al menos uno de dichos reactivos comprende un soporte sólido que comprende un segundo polisacárido, en la que dichos reactivos comprenden una pareja de unión específica y en la que dicha proteína no se une 30 a ninguno de dichos reactivos ni a dicho analito.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que cuando L es un grupo de unión, L tiene la fórmula:

- CH2 (CH2) mCH2-NR-CH2 (CH2) pCH2

en la que m y p son independientemente números enteros de 0 a aproximadamente 5, R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior y arilo, o L tiene la fórmula:

- CH2 (CH2) mCH2-NR-CHR (CH2) pCO

en la que m y p son independientemente números enteros de 0 a aproximadamente 5, y R y R se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior y arilo.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha proteína es una proteína sérica. 45

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicha proteína sérica se selecciona del grupo que consiste en albúminas y gamma-globulinas.

5. Composición según una de las reivindicaciones 1-4, en la que el polisacárido del conjugado proteína50 polisacárido es dextrano o un derivado de dextrano.

6. Método para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar en combinación dicha muestra y una composición según una de las reivindicaciones 1-5,

(b) incubar dicha combinación en condiciones para la unión de dicho analito a uno o más de dichos reactivos, y

(c) detectar la presencia y/o la cantidad de unión de dicho analito a uno o más de dichos reactivos, estando

relacionada la presencia y/o la cantidad de dicha unión con la presencia y/o la cantidad de dicho analito en dicha muestra.

7. Método para reducir la unión no específica en un ensayo de unión para la determinación de un analito en una muestra, comprendiendo dicho método incluir en un medio de ensayo para realizar dicho ensayo de 10 unión una composición según una de las reivindicaciones 1-5.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho compuesto soluble tiene una carga neutra o una carga negativa.

9. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho primer polisacárido y dicho segundo polisacárido son iguales.

10. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que el comportamiento de unión por afinidad de dicho compuesto soluble es mejor que el comportamiento de unión por afinidad de dicho segundo polisacárido 20 sobre dicho soporte.

11. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho soporte sólido comprende partículas.

12. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho segundo polisacárido se une a dicho soporte sólido y 25 un miembro de un par de unión específica se une a dicho segundo polisacárido.

13. Método según la reivindicación 7, en el que dicho primer polisacárido y dicho segundo polisacárido comprenden la misma subunidad de polímero de monosacárido pero difieren en el peso molecular.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el peso molecular de dicho primer polisacárido es mayor que el peso molecular de dicho segundo polisacárido.

15. Composición según una de las reivindicaciones 1-5, en la que en el conjugado proteína-polisacárido la proteína y el polisacárido se unen entre sí con una unión que tiene sustancialmente la misma estructura química que la unión usada para unir dicho miembro de un par de unión específica a dicho segundo polisacárido unido a dicho soporte sólido según la reivindicación 12.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que la unión difiere en la homología.

17. Método para determinar la presencia y/o la cantidad de un analito en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar en combinación dicha muestra, un compuesto soluble que comprende una proteína unida a un primer polisacárido, y reactivos para detectar dicho analito, en el que al menos uno de dichos reactivos 45 comprende un soporte sólido que comprende un segundo polisacárido, en el que dichos reactivos comprenden una pareja de unión específica y en el que dicha proteína no se une a ninguno de dichos reactivos ni a dicho analito y en el que dicho primer polisacárido y dicho segundo polisacárido pueden ser iguales o diferentes, 50 (b) incubar dicha combinación en condiciones para la unión de dicho analito a uno o más de dichos reactivos, y (c) detectar la presencia y/o la cantidad de unión de dicho analito a dicha pareja de unión específica para dicho analito, estando relacionada la presencia y/o la cantidad de dicha unión con la presencia y/o la 55 cantidad de dicho analito en dicha muestra.