PREPARACIÓN DE UN PREPARADO DE FACTOR DE VON WILLENBRAND CON ELEVADA ACTIVIDAD ESPECÍFICA.

Procedimiento para la separación de FVW con elevada actividad de FVW con baja actividad,

que comprende una cromatografía con hidroxilapatita como matriz cromatográfica, con la que se obtiene una preparación de VWF con elevada actividad que presenta una actividad específica del FVW de al menos 50 E/mg de antígeno de FVW

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un preparado de factor de von Willenbrand con actividad específica del FVW incrementada, en el que se utiliza hidroxilapatita como medio cromatográfíco.

El factor de von Willenbrand es una glucoproteína que se sintetiza en las células endoteliales y megacariocitos. El peso molecular del monómero asciende a aproximadamente 225.000 Da. Mediante la formación de puentes disulfuro se forman en la célula dímeros que de nuevo se asocian formando oligómeros de hasta 40 subunidades dímeras igualmente a través de enlaces disulfuro. La concentración del factor de von Willebrand (FVW) suministrado al plasma asciende a 5-10 mg/l.

En la hemostasia primaria el FVW tiene la función de mediar la adhesión de los trombocitos al subendotelio lesionado y auxiliar en condiciones de fuerzas de corte elevadas, como en el sistema arterial, la agregación de trombocitos. Como función en la hemostasia secundaria el FVW se une al factor VIII, un importante cofactor en la coagulación sanguínea, en un complejo no covalente. El factor VIII se estabiliza de este modo y se protege de la degradación prematura.

El síndrome de von Willebrand (SVW) es una enfermedad sanguínea que es causada por variación cualitativa o cuantitativa del FVW. Frecuentemente para el tratamiento de formas graves del SVW se utilizan preparados plasmáticos del factor VIII que contienen una proporción relativamente alta de FVW. De este modo pueden ciertamente cortarse hemorragias, pero simultáneamente aumenta, en especial con una aplicación frecuente o prolongada, el riesgo de trombosis. Esto puede atribuirse a una sobredosificación de factor VIII. Es esencialmente adecuado en el sentido de la seguridad de los pacientes la terapia de enfermos de SVW con concentrados de FVW de alta pureza pobres en / libres de factor VIII.

Un problema frecuente en la preparación de un preparado de FVW es la pérdida de actividad específica del FVW. Según la definición anteriormente mencionada a una concentración de FVW de 5-10 µg/l en sangre y una actividad definida de en promedio 1 E/ml, la actividad específica del FVW asciende a 100 -200 E por mg de antígeno de FVW. Por regla general la actividad específica del FVW cae drásticamente durante el primer paso del procesamiento en la preparación de preparados de FVW. Esta pérdida de actividad específica se correlaciona estructuralmente con reacciones de degradación proteolíticas que conducen a la reducción de la proporción de moléculas de FVW macromoleculares (multímeros) y a la elevación de la proporción de moléculas de FVW de bajo peso molecular (dímeros / tetrámeros).

En la literatura se describen distintos procedimientos que buscan una elevación de la actividad específica del FVW para contrarrestar esta problemática.

El documento WO 98/38219 describe un procedimiento para la obtención de FVW en el que el FVW se une a un intercambiador catiónico a una baja concentración salina y mediante elución fraccionada se obtiene FVW de elevada actividad específica.

El documento WO 96/10584 describe un procedimiento para la obtención de FVW recombinante de alta pureza mediante cromatografía de afinidad de intercambio aniónico/heparina y el documento EP 0 705 846 la separación de fracciones de alto y bajo peso molecular de FVW recombinante mediante cromatografía de afinidad de heparina.

La publicación de A.B. Federici, Haematologica (Junio 2003), 88, nº 6, 3-12 describe composiciones que contienen FVW. El documento US 5,128,254 da a conocer la purificación cromatográfica de componentes de megacariocitos o plaquetas como el factor de von Willebrand.

La publicación de Gorman y Ekert (1978), Thrombosis Research 12, 341-352 describe estudios sobre la estructura y la síntesis de factor antihemófilo humano. A este respecto el factor antihemofílico humano se purificó mediante cromatografía con hidroxilapatita que siguió a una precipitación de plasma y a una filtración en gel. La actividad coagulante del factor VIII y la actividad del FVW eluyeron simultáneamente.

La publicación de Saundry y col. (1987), Thrombosis Research 48, 641-652 da a conocer la purificación cromatográfica de ag:FVW usando dextrano-sulfato (DS) agarosa.

Barington y Kaersgaard (1999), Vox Sanguinis 76, 85-89 describen estudios para proporcionar factor de von Willenbrand de alta pureza que contenga multímeros de alto peso molecular.

Burnouf-Radosevich y Burnouf (1992), Vox Sanguinis 62, 1-11 describen estudios para el procesamiento cromatográfico de un concentrado de factor de von Willenbrand purificado a partir de un crioprecipitado humano.

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Los procedimientos descritos hasta ahora adolecen de inconvenientes en lo que respecta a rentabilidad y efectividad de purificación. En el uso de una cromatografía de afinidad de heparina para aumentar la actividad específica del FVW se aumentó por ejemplo la actividad de una disolución de proteínas purificada previamente que contenía el FVW recombinante de 4,3 E por mg de antígeno de FVW a 7,3 E/mg. La actividad específica final del FVW de la proteína recombinante es baja. Los costes de una cromatografía de afinidad son comparativamente altos. Se consiguieron mejores resultados aplicando una cromatografía de intercambio catiónico. En la purificación de un anticuerpo recombinante se consiguió en combinación con cromatografía de intercambio aniónico y de inmunoafinidad preconectada una actividad específica del FVW de 30,4 E/mg. En el ejemplo de la purificación de un FVW plasmático mediante la combinación de cromatografía de intercambio catiónico e intercambio aniónico se alcanzó una pureza lograda de 65 E/mg de proteína. No se abordó el incremento de la actividad específica del FVW (actividad por cantidad de antígeno de FVW).

Existe la necesidad de un procedimiento rentable con el que puedan empobrecerse moléculas de FVW poco activas de una fracción de proteína para aumentar así la actividad específica. A este respecto debe alcanzarse una actividad específica del FVW que corresponda a la del hombre sano en el plasma. Conforme a la invención este objetivo se consigue mediante un paso de separación cromatográfico usando hidroxilapatita.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la separación de FVW con elevada actividad de FVW con baja actividad, que comprende una cromatografía con hidroxilapatita como matriz cromatográfica, con la que se obtiene una preparación de VWF con elevada actividad que presenta una actividad específica del FVW de al menos 50 E/mg de antígeno de FVW. Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la preparación de una composición con una actividad específica del FVW de al menos 50 E/mg de antígeno de FVW, caracterizado porque se purifica una composición que contiene FVW mediante cromatografía con hidroxilapatita, en la que el FVW se une a la matriz de la columna de hidroxilapatita, el FVW con baja actividad específica se expulsa por lavado y a continuación se eluye el FVW de elevada actividad específica con mayor concentración salina, conteniendo el tampón de lavado 100-300 mM, preferiblemente 200-300 mM, y el tampón de elución 200-500 mM, preferiblemente 300-400 mM, de fosfato sódico o potásico.

La hidroxilapatita es una forma de fosfato cálcico con la composición Ca5(PO4)3OH ó Ca10(PO4)6OH2 que puede utilizarse como fase estacionaria para la cromatografía de proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. Además de la forma cristalina también puede utilizarse una forma cerámica que puede obtenerse por sinterización. La hidroxilapatita puede adquirirse por ejemplo en la firma Bio-Rad (Munich, Alemania). Su hidroxilapatita cerámica se proporciona en dos formas (tipo 1 y tipo 2). El material de tipo 1 tiene debido a su mayor superficie una mayor capacidad de unión para moléculas más pequeñas, p.ej. proteínas pequeñas. Por el contrario el material de tipo 2 presenta mayores poros en las partículas que hacen posible una penetración y con ello una mejor unión de moléculas grandes. p.ej. ADN o proteínas grandes. Los materiales presentan preferiblemente las siguientes propiedades:

Tabla 1

La hidroxilapatita cristalina o cerámica está disponible libremente. Son conocidos procedimientos para... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la separación de FVW con elevada actividad de FVW con baja actividad, que comprende una cromatografía con hidroxilapatita como matriz cromatográfica, con la que se obtiene una preparación de VWF con elevada actividad que presenta una actividad específica del FVW de al menos 50 E/mg de antígeno de FVW.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque el tampón de lavado contiene 100-300 mM, preferiblemente 200-300 mM, y el tampón de elución 200-500 mM, preferiblemente 300-400 mM, de fosfato sódico o potásico.

3. Procedimiento para la preparación de una composición con una actividad específica del FVW de por lo menos 50 E/mg de antígeno de FVW, caracterizado porque se purifica una composición que contiene FVW mediante cromatografía con hidroxilapatita, en la que el FVW se une a la matriz de la columna de hidroxilapatita, el FVW con baja actividad específica se expulsa por lavado y a continuación se eluye el FVW de elevada actividad específica con mayor concentración salina, conteniendo el tampón de lavado 100-300 mM, preferiblemente 200-300 mM, y el tampón de elución 200-500 mM, preferiblemente 300-400 mM, de fosfato sódico o potásico.

4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cromatografía se lleva a cabo a un valor del pH entre 5 y 7, preferiblemente entre 5,5 y 6,8.

5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque como tampón de desarrollo se utiliza una solución que contiene fosfato sódico o potásico.

6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en primer lugar se lleva a cabo una cromatografía de paso con hidroxilapatita, la fracción de paso se recromatografía en condiciones de unión y la proteína objetivo se eluye como fracción de FVW de alta pureza.

7. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se utiliza hidroxilapatita cerámica.

8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7, caracterizado porque la hidroxilapatita cerámica es del tipo I o del tipo II.

9. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como material de partida se utiliza una fracción plasmática prepurificada.

10. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como material de partida se utiliza una disolución de crioprecipitado purificada adicionalmente.

11. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque como material de partida se utiliza una disolución de crioprecipitado precipitado con hidróxido de aluminio.

12. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como material de partida se utiliza una disolución de crioprecipitado precipitado con hidróxido de aluminio prepurificada cromatográficamente.

13. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque antes de la cromatografía con hidroxilapatita se lleva a cabo una precipitación por pH para la separación de fibronectina.

14. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como material de partida se utiliza una disolución de proteínas con FVW preparado de manera recombinante.

15. Uso de hidroxilapatita para la preparación de un preparado de FVW con elevada actividad específica que ascienda por lo menos a 50 E/mg de antígeno de FVW.