PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION ESPECIFICA DE LEGIONELLA PNEUMOPHILA.
Método para la detección específica de la presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se sospecha que contiene L.
pneumophila, y que comprende además uno o más microorganismos distintos, caracterizado por el hecho de que
(i) la muestra se analiza para identificar la presencia de un gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila; y
(ii) se evalúa la cantidad del gen fis de Legionella pneumophila presente en la muestra y si la muestra comprende el gen fis de Legionella pneumophila es una prueba de que Legionella pneumophila está presente en la muestra;
en donde el gen fis de Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado del grupo de genes fis que consiste en:
(a) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-282 de la SEC ID Nº 1 (denominada "fis1");
(a1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-93 de la SEC ID Nº 2 (denominada "FIS1");
(b) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-297 de la SEC ID Nº 3 (denominada "fis2");
(b1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-98 de la SEC ID Nº 4 (denominada "FIS2");
(c) un gen fis que comprende una secuencia de ADN que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-288 de la SEC ID Nº 5 (denominada "fis3"); y
(c1) un gen fis que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con el polipéptido mostrado en las posiciones 1-95 de la SEC ID Nº 6 (denominada "FIS3")
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/068592.
Solicitante: UNIVERSITAT DE GIRONA.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: CALVO,LAIA, GARCIA-GIL,JESUS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M10B
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la detección específica de Legionella pneumophila.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la detección específica de la presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se sospecha que contiene L. pneumophila y que comprende además uno o más microorganismos distintos.
Antecedentes
La Legionella pneumophila es una bacteria gram negativa en forma de bacilo que es el agente causal de un alto porcentaje de neumonías tanto intrahospitalarias como extrahospitalarias. Cuando aparece la legionelosis, puede ser mortal si el diagnóstico y el tratamiento no se establecen rápidamente, particularmente en ancianos y pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto, son necesarios métodos de diagnóstico y detección rápidos para mejorar el desenlace de los pacientes infectados. Dentro del género Legionella hay varias especies distintas de L. pneumophila que no están dando problemas de virulencia significativos para seres humanos.
En la actualidad, la detección de Legionella se está realizando tanto ambiental como clínicamente.
En el entorno, se encuentra típicamente en varios entornos acuáticos incluyendo los más directamente relacionados con actividades humanas tales como torres de refrigeración y sistemas de distribución de agua potable de uso domésticos. Más recientemente, se ha demostrado la presencia de esta bacteria en aguas subterráneas.
En muestras clínicas, la Legionella puede obtenerse directamente de esputo, lavado broncoalveolar o aspiración traqueal. En la legionelosis avanzada, también puede cultivarse a partir de muestras de sangre.
Recientemente, la detección molecular por medio de técnicas basadas en PCR se ha convertido en un procedimiento común para la identificación rápida de Legionella. Se han puesto en práctica protocolos de PCR tanto a tiempo real modernos como convencionales, que se dirigen a varios genes que contienen secuencias únicas distintivas.
Los métodos basados en PCR descritos hasta la fecha se dirigen a varios genes filogenéticos y funcionales e incluyen oligonucleótidos que se dirigen específicamente a regiones del operón ribosómico tales como el espaciador 23S-5S (Herpers, B. L, et al, (2003), J. Clin. Microbiol., 41, 4815-4816) o el ARNr 16S (Lisby et al, (1994) Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 13, 225-231).
No obstante, los genes funcionales implicados en la virulencia y la infectividad son actualmente los marcadores de elección para la mayoría de procedimientos de PCR. Los genes usados más ampliamente hasta la fecha son mip (potenciador de la infectividad de macrófagos) y dotA (defecto en el transporte de orgánulos). El gen mip fue de hecho la primera diana molecular (ADN) para la detección por PCR de Legionella y codifica una proteína de 24 kDa (Mip), un factor de virulencia que consiste en una proteína de superficie que facilita que L. pneumophila parasite macrófagos humanos y cause neumonía en animales de experimentación. Mip contiene secuencias específicas que pueden usarse para distinguir especies de Legionella entre sí (Mahbubani, et al, (1990), Mol Cell Probes, 4, 175-187). El gen dotA (defecto en el transporte de orgánulos) codifica una proteína que regula el transporte del fagosoma de L. pneumophila (Roy, et al, (1998), Mol Microbiol, 28, 663-674). El documento US5935782 describe el uso de los genes frgA y hbp para la detección de L. pneumophila. Los genes frgA y hbp están funcionalmente relacionados con mip y por lo tanto también pueden caracterizarse como genes implicados en la virulencia y la infectividad.
Sin embargo, todos estos genes relacionados con factores de virulencia y patogénicos (por ejemplo, mip y dotA) es probable que estén inactivos durante la vida ambiental normal de este microorganismo, y por lo tanto, no puedan usarse para la determinación de bacterias viables en muestras ambientales.
Resumen de la invención
El problema a resolver por la presente invención es proporcionar un método para detectar específicamente Legionella pneumophila, en el cual el método proporciona la posibilidad de determinar si existe Legionella pneumophila viable en, por ejemplo, muestras ambientales.
La solución se basa en que los presentes inventores han identificado que un grupo específico de genes de Legionella conocidos con el término fis (factor para la estimulación de la inversión) comprende suficientes secuencias específicas que pueden usarse para detectar específicamente Legionella pneumophila en una muestra que comprende además uno o más microorganismos distintos tales como una o más especies distintas de Legionella aparte de L. pneumophila.
El gen fis pertenece a la familia de genes de "transcripción", categoría K. Se conocen genes fis en diferentes organismos tales como, por ejemplo, E. coli y Salmonella. También se sabe que están presentes en Legionella pneumophila (véase a continuación para más detalles). Un gen de "transcripción" tal como fis es crítico para el desarrollo celular y puede denominarse gen "constitutivo". Los expertos en la materia saben que dichos genes "constitutivos" están generalmente muy conservados entre especies diferentes de un género. Sin embargo, como se ha dicho anteriormente, sorprendentemente los genes fis de Legionella pneumophila como se describen en la presente memoria comprenden secuencias específicas suficientes que pueden usarse para distinguir específicamente Legionella pneumophila de otras especies de Legionella diferentes. Véanse, por ejemplo, los resultados 2.3 de los ejemplos de trabajo del presente documento, en los cuales se demuestra que Legionella pneumophila puede distinguirse específicamente de varias especies diferentes de Legionella y también de otros microorganismos relevantes. Los resultados proporcionados en la sección de resultados 2.3 se basan en PCR convencional usando ADN genómico y cebadores orientados hacia un gen fis de Legionella pneumophila como se describe en la presente memoria.
Además, los genes fis "constitutivos" como se describen en la presente memoria tienen, como los genes "constitutivos" normales, niveles de expresión detectables durante las fases latentes de su ciclo de vida. Por consiguiente, midiendo los niveles de expresión de ARNm se puede determinar si está presente Legionella pneumophila viable en muestras ambientales. Véanse los resultados 2.7 de los ejemplos de trabajo de la presente memoria, en los cuales se demuestra esto basándose en el uso de PCR con transcripción inversa (RT).
Ésta es una ventaja muy importante sobre el uso de la técnica anterior de genes de factores de virulencia y patogenicidad (por ejemplo, mip y dotA) que generalmente sólo tienen un nivel de expresión significativo durante la virulencia y por lo tanto su viabilidad sólo puede determinarse en muestras clínicas humanas y no en muestras ambientales (por ejemplo, en entornos acuáticos obtenidos de edificios).
Además, los genes funcionales como los enumerados en la sección de antecedentes anterior están sometidos normalmente a una fuerte variabilidad, principalmente debido a mutaciones silenciosas en la tercera base del codón. Esto significa que, por ejemplo, en un oligonucleótido de 21 pares de bases, hasta siete posiciones están en riesgo de ser inespecíficas, debido a la variabilidad genética natural de poblaciones bacterianas, que puede comprometer la especificidad del sistema de PCR. Por alguna razón, el gen fis como se analiza en la presente memoria, no muestra esta variabilidad, convirtiéndolo en una diana ideal porque (i) es un gen funcional con expresión de ARNm detectable y cuantificable, y (ii) tiene una secuencia altamente conservada.
La secuencia genómica completa de Legionella pneumophila subesp. pneumophila cepa Philadelphia 1 se describe en [Chien, et al (2004), The genomic sequence of the accidental pathogen Legionella pneumophila, Science, 305, 1966-1968]. La secuencia genómica completa tiene el número de acceso de GenBank AE017354. Los tres genes fis de Legionella pneumophila descritos en la presente memoria se describen en Chien, et al. Los genes fis son:
el gen denominado en...
Reivindicaciones:
1. Método para la detección específica de la presencia de Legionella pneumophila en una muestra que se sospecha que contiene L. pneumophila, y que comprende además uno o más microorganismos distintos, caracterizado por el hecho de que
en donde el gen fis de Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado del grupo de genes fis que consiste en:
2. El método de la reivindicación 1, en el cual el uno o más microorganismos distintos comprendidos dentro de la muestra es uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en otras especies de Legionella distintas de L. pneumophila, E. coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Serratia, Proteus, Enterococcus, Arthrobacter y Listeria.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el uno o más microorganismos comprendidos dentro de la muestra es una o más especies de Legionella distintas de L. pneumophila, tal como en particular una o más especies de Legionella seleccionadas del grupo que consiste en L gormanii, L. longbeacheae, L. anisa, L. oakridgensis, L. fairfieldensis, L. feelei, L. dumofii, L. micdadei, L. jordanis, L. wadsworthii y L. bozemanii.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el método es un método para la detección de Legionella pneumophila viable en una muestra, caracterizado por el hecho de que
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la muestra es una muestra ambiental obtenida de un entorno acuático, preferiblemente en el cual el entorno acuático está situado en un lugar relevante tal como un edificio, una torre de refrigeración, un sistema de distribución de agua potable para uso doméstico o aguas subterráneas.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el gen fis de Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado de un grupo de genes fis que consiste en:
O más preferiblemente, en el cual el gen fis de Legionella pneumophila es un gen fis seleccionado de un grupo de genes fis que consiste en:
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el análisis para identificar la presencia de un gen fis (factor para la estimulación de la inversión) o de ARNm expresado de Legionella pneumophila a partir del gen fis de acuerdo con la etapa (i) del método, se realiza mediante una técnica de amplificación génica adecuada [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico) o Amplificación por Desplazamiento de Cadena (SDA)] para amplificar el gen pertinente o el ARNm expresado a partir del gen, y en el cual la técnica de amplificación se realiza de manera que es capaz de amplificar específicamente el gen fis (factor para la estimulación de la inversión) analizado o el ARNm expresado de Legionella pneumophila a partir del gen y de no amplificar cantidades medibles de secuencias de genes fis de uno o más microorganismos distintos comprendidos adicionalmente en la muestra.
8. El método de la reivindicación 7, en el cual la técnica de amplificación génica adecuada es PCR (preferiblemente PCR a tiempo real) y en el cual los cebadores de PCR se construyen de tal manera que los cebadores de PCR amplifiquen específicamente el gen fis (factor de estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila analizado o el ARNm expresado a partir del gen y no amplifiquen cantidades medibles de secuencias de genes fis del uno o más microorganismos distintos comprendidos además en la muestra.
9. El método de la reivindicación 8, en el cual los cebadores de PCR se seleccionan del grupo de cebadores de PCR que consiste en:
SEC ID Nº 7 (denominado Fis41 F): 5'-CAC TAG CCG AAA GCG TGA CTC-3'; y
SEC ID Nº 8 (denominado Fis171 R): 5'-ATG TTC CAT TAC TGC ACG AAA TAG AG-3'.
10. El método de las reivindicaciones 8 ó 9, en el cual la técnica de PCR es PCR con transcripción inversa (RT) y se realiza la detección de la presencia de Legionella pneumophila viable en la muestra amplificando específicamente ARNm expresado a partir del gen fis (factor para la estimulación de la inversión) de Legionella pneumophila analizado.
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