INTERFERENCIA DE ARN ESPECIFICO DE ALELOS.

Un procedimiento ex vivo para inhibir selectivamente la expresión de un alelo objetivo mutante de un gen SOD1 en una célula que comprende alelos de tipo salvaje y mutantes del gen,

en donde el alelo objetivo comprende una mutación puntual correlacionada con la esclerosis lateral amiotrófica, el procedimiento comprende administrar a la célula un siARN específico para la mutación puntual de tal modo que ocurre la interferencia de ARN específica de alelos del alelo objetivo mutante y se preserva la expresión del alelo de tipo salvaje, en donde el siARN es apareado completamente con un mARN mutante codificado por el alelo mutante pero forma un mal apareamiento de un solo nucleótido con un mARN de tipo salvaje codificado por el alelo de tipo salvaje

Interferencia de ARN específico de alelos.

Antecedentes

Enfermedades causadas por mutaciones génicas que producen una ganancia de función, dominantes, se desarrollan en heterocigotas que llevan una copia del gen mutante y una de tipo salvaje. Algunas de las enfermedades más conocidas de esta clase son las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS; "enfermedad de Lou Gehrig") (Taylor et al., 2002). En estas enfermedades, no están claras las vías exactas por las que las proteínas mutantes causan la degeneración celular, pero se sabe que el origen de la toxicidad celular es la proteína mutante.

Las mutaciones en SOD1 causan degeneración neuronal motora que lleva a la ALS, debido a que la proteína mutante ha adquirido alguna propiedad tóxica (Cleveland et al., 2001). No se comprende aún ni la naturaleza de esta propiedad tóxica ni la vía corriente abajo que lleva a la eventual degeneración neuronal motora. En ratones, sólo la expresión de la mutante SOD1, pero no la eliminación de SOD1 por knockout de genes, causa la ALS. No obstante, los ratones con knockout de genes desarrollan numerosas anormalidades incluyendo fertilidad reducida (Matzuk et al., 1990), axonopatía motora (Shefner et al., 1999), pérdida de células de los pelos cocleares asociada con la edad (McFadden et al., 2001) y sinapsis de las uniones neuromusculares (Flood et al., 1999) y susceptibilidad aumentada a una variedad de ataques nocivos, tales como excitotoxicidad, isquemia, neurotoxinas e irradiación, sobre el SNC y otros sistemas (Matz et al., 2000; Kondo et al., 1997; Kawase et al., 1999; Behndig et al., 2001). Dada la toxicidad de la mutante y la importancia funcional de la proteína de tipo salvaje, la terapia ideal para esta enfermedad sería bloquear selectivamente la expresión de la proteína mutante mientras se retiene la expresión del tipo salvaje.

Cancer Cell: Septiembre 2002, Vol. 2, 243-247, Brummelkamp et al, divulgan la supresión estable de tumorigenicidad por interferencia de ARN mediada por virus.

Cancer Research 2024-028, Abril 2002, Fluiter et al, divulgan inhibición específica del genotipo de tumores in vivo por oligonucleótidos antisentido contra un sitio polimórfico de la subunidad grande de la ARN polimerasa II humana.

El documento WO-A-98/48009 divulga materiales y procedimientos para el tratamiento con ribozimas de las enfermedades de la retina.

Sumario

La presente invención se refiere a nuevos procedimientos para tratar las enfermedades causadas por ganancia de función, dominante. En particular, la invención provee procedimientos para la destrucción selectiva de mARNs mutantes transcriptos de genes con ganancia de función, evitando así la producción de proteínas mutantes codificadas por tales genes. La invención se basa en parte en el descubrimiento de que los ARNs de interferencia (siARNs) pequeños y los ARNs en horquilla (shARNs) pequeños pueden ser diseñados para inhibir selectivamente la expresión de un alelo mutante, por ejemplo, G85R SOD1 o G93A SOD1, mientras conservan la expresión de la proteína de tipo salvaje, con especificidad de un solo nucleótido.

Los procedimientos de la invención utilizan la tecnología de interferencia de ARN (ARNi) contra mutaciones puntuales seleccionadas que ocurren en un solo alelo en un gen mutante, por ejemplo, la mutación puntual en el gen de la superóxido dismutasa de cobre y zinc (SOD1) asociado con la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). El ARNi puede mediar la supresión selectiva de secuencias de la expresión de genes en una amplia variedad de eucariotas introduciendo dúplex de ARN cortos (denominados ARNs o siARNs de interferencia pequeños) con homologías de secuencias con respecto al gen objetivo (Caplen et al., 2001; Elbashir et al., 2001c). Los dúplex de siARN o vectores que expresan los shARNs de la presente invención se pueden usar para silenciar la expresión de un gen mutante tóxico selectivamente, por ejemplo, la proteína mutante SOD1, permitiendo de este modo que el alelo de SOD1 de tipo salvaje continúe funcionando.

La invención se basa también en el descubrimiento de nuevos precursores de ARN artificiales, creados por ingeniería genética, los cuales, cuando se expresan en una célula, por ejemplo, in vivo, son procesados por la célula para producir siARNs que son el objetivo que silencian selectivamente a los alelos mutantes de los genes objetivo (teniendo como objetivo mARNs específicos para la escisión) usando la vía de ARNi propia de la célula. Mediante la introducción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican a estos precursores de ARN creados por ingeniería genética en células in vivo con secuencias reguladoras apropiadas (por ejemplo, un transgén en un vector tal como un plásmido), la expresión de los precursores de ARN creados por ingeniería genética puede ser controlada selectivamente, tanto temporalmente como espacialmente, es decir, en momentos particulares y/o en tejidos, órganos o células particulares.

En un aspecto, la invención presenta un procedimiento para inhibir la expresión de un alelo objetivo en una célula que comprende por lo menos dos alelos diferentes de un gen mediante la administración a la célula de un siARN específico para el alelo objetivo. En una forma de realización, el alelo objetivo está correlacionado con un trastorno asociado con una mutación con ganancia de función, dominante. En otra forma de realización, el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno correlacionado con la presencia de un alelo mutante con ganancia de función, dominante, el procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un siARN específico para el alelo mutante. En una forma de realización, el siARN es el objetivo de la mutación con ganancia de función. En otra forma de realización, el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson.

En una forma de realización, la enfermedad es esclerosis lateral amiotrófica. En una forma de realización adicional, el alelo es un alelo mutante de SOD1.

En una forma de realización, el siARN tiene como objetivo un alelo de SOD1 mutante (SEQ ID NO:8) y comprende, o consiste en, una secuencia de siARN mutante como se presenta en la Figura 1A prefiriéndose P10 (SEQ ID NO:4), seguido por P9 (SEQ ID NO: 2), seguido por P11 (SEQ ID NO:6).

En otra forma de realización, el siARN (por ejemplo, un siARN control) tiene como objetivo un alelo de SOD 1 de tipo salvaje y comprende, o consiste en, una secuencia de siARN de tipo salvaje como se presenta en la Figura 1A prefiriéndose P9 (SEQ ID NO:14) o P10 (SEQ ID NO:12), seguido por P11 (SEQ ID N0:10).

En otro aspecto, la invención provee un siARN que comprende una secuencia como se presenta en la Figura 1A.

En otro aspecto, la invención provee un siARN mutante p10 que comprende la secuencia como se presenta en la Figura 1A (SEQ ID NO: 4).

En otro aspecto, la invención provee un siARN mutante p9 que comprende la secuencia presentada en la Figura 10 1A (SEQ ID NO: 2).

En otro aspecto, la invención provee un shARN de SOD1 G93A que comprende la secuencia como se presenta en la Figura 3A (SEQ ID NO: 16), así como también constructos de expresión que comprenden los shARNs de la invención.

En otro aspecto, la invención provee composiciones terapéuticas específicas que comprenden los siARNs y/o shARNs de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Los dúplex de ARN pueden discriminar entre SOD1 mutante y de tipo salvaje in vitro. (A) dúplex de ARN usados: siARN P11 mutante (SEQ ID NO: 5, sentido; SEQ ID NO: 6, anti-sentido o guía), siARN P10 mutante (SEQ ID NO: 3, sentido; SEQ ID NO: 4, anti-sentido o guía), siARN P9 mutante (SEQ ID NO: 1, sentido; SEQ ID NO: 2 anti-sentido o guía), SOD1 objetivo de tipo salvaje (SEQ ID NO: 7), SOD1 mutante objetivo (SEQ ID NO: 8), siARN P11 de tipo salvaje...

1. Un procedimiento ex vivo para inhibir selectivamente la expresión de un alelo objetivo mutante de un gen SOD1 en una célula que comprende alelos de tipo salvaje y mutantes del gen, en donde el alelo objetivo comprende una mutación puntual correlacionada con la esclerosis lateral amiotrófica, el procedimiento comprende administrar a la célula un siARN específico para la mutación puntual de tal modo que ocurre la interferencia de ARN específica de alelos del alelo objetivo mutante y se preserva la expresión del alelo de tipo salvaje, en donde el siARN es apareado completamente con un mARN mutante codificado por el alelo mutante pero forma un mal apareamiento de un solo nucleótido con un mARN de tipo salvaje codificado por el alelo de tipo salvaje.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el mal apareamiento de un solo nucleótido es un mal apareamiento purina: purina.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el mal apareamiento es un mal apareamiento G:G.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mutación puntual es una mutación con ganancia de función dominante.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los alelos mutantes y de tipo salvaje difieren por:

(a) sólo uno, dos o tres nucleótidos; o

(b) un solo nucleótido.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el mal apareamiento está ubicado en la posición de nucleótido 9 (P9) con relación al extremo 5' de la hebra antisentido del siARN, o la posición 10 (P10) con relación al extremo 5' de la hebra antisentido del siARN.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el alelo del mutante codifica una mutación de glicina a arginina en la posición de aminoácido 85 (G85) de una proteína SOD1 mutante, o una mutación de glicina a alanina en la posición de aminoácido 93 (G93A) de una proteína SOD1 mutante.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el siARN es o bien:

(a) un siARN que comprende (i) una secuencia de hebra sentido que corresponde a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 3; y (ii) una secuencia de hebra antisentido presentada como SEQ ID NO:4; o

(b) un siARN que comprende (i) una secuencia de hebra sentido que corresponde a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 1; y (ii) una secuencia de hebra antisentido presentada como SEQ ID NO:2.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el siARN es administrado a la célula en forma de un shARN, en donde el shARN es escindido en la célula para generar el siARN.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el shARN es un shARN de SOD1 G93A.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el shARN tiene la secuencia presentada como SEQ ID NO:16.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el shRNA es expresado de un constructo de expresión.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el shRNA es expresado bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa III (U6).

14. Un siARN para tratar la esclerosis lateral amiotrófica asociada con una proteína mutante codificada por un alelo objetivo mutante de un gen SOD1 en un sujeto, en el que el siARN inhibe selectivamente la expresión del alelo objetivo mutante, en el que el sujeto tiene alelos mutantes y de tipo salvaje del gen, en el que el siARN es específico para una mutación puntual en el alelo objetivo mutante, de tal modo que ocurre una interferencia de ARN especifica de alelos del alelo objetivo mutante y se preserva la expresión del alelo tipo salvaje, en donde el siRNA es apareado completamente con un mARN mutante codificado por el alelo mutante pero comprende un mal apareamiento de un solo nucleótido con un mARN de tipo salvaje codificado por el alelo de tipo de salvaje.

15. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el mal apareamiento del nucleótido único es un mal apareamiento purina:purina.

16. El siARN de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el mal apareamiento es un mal apareamiento G:G.

17. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la mutación puntual es una mutación con ganancia de función dominante.

18. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que los alelos mutantes y de tipo salvaje difieren por:

(a) sólo uno, dos o tres nucleótidos; o

(b) un solo nucleótido.

19. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el mal apareamiento está ubicado en una posición de nucleótido 9 (P9) con relación al extremo 5' de la hebra antisentido del siARN, o una posición de nucleótido 10 (P10) con relación al extremo 5' de la hebra antisentido del siARN.

20. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el alelo mutante codifica una mutación de glicina a arginina en la posición de aminoácido 85 (G85R) de una proteína SOD1 mutante, o una mutación de glicina a alanina en la posición de aminoácido 93 (G93A) de una proteína SOD1 mutante.

21. El siARN de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el siARN es:

(a) un siARN que comprende (i) una secuencia de hebra sentido que corresponde a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 3; y (ii) una secuencia de hebra antisentido presentada como SEQ ID NO:4; o

(b) un siRNA que comprende (i) una secuencia de hebra sentido que corresponde a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 1; y (ii) una secuencia de hebra antisentido presentada como SEQ ID NO:2.

22. El siARN de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el siARN es administrado a la célula en forma de un shARN, en donde el shARN es escindido en la célula para generar el siARN.

23. El siARN de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el shARN es un shARN de SOD1 G93A.

24. El siARN de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el shARN tiene la secuencia presentada como la SEQ ID NO:16.

25. El siARN de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el shARN es expresado de un constructo de expresión.

26. El siARN de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el shARN es expresado bajo el control de un promotor de ARN polimerasa III (U6).