Célula transformada seleccionada de:

a) una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la VKOR;

b) una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y ARNip que inhibe la función de la VKOR;

c) una célula que comprende un ácido nucleico antisentido que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR); o

d) una célula que comprende un ARNip que inhibe la función de la vitamina K epóxido reductasa (VKOR)

Células que coexpresan vitamina K reductasa y proteína dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha proteína dependiente de vitamina K.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos aislados, a células huésped que contienen los mismos y a métodos de uso de los mismos, así como a métodos para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula.

Antecedentes de la invención

La función de numerosas proteínas requiere la modificación de múltiples residuos de ácido glutámico a ?-carboxi-glutamato. Entre éstas, las proteínas de coagulación dependientes de vitamina K (VKD), FIX (factor Christmas), FVII y protrombina son las mejor conocidas. La observación de que la desactivación del gen de la proteína Gla de la matriz da como resultado la calcificación de las arterias del ratón (Luo et al. (1997) "Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein" Nature 386:78-81) enfatiza la importancia del ciclo de la vitamina K para proteínas con funciones diferentes a la coagulación. Además, Gas6 y otras proteínas Gla de función desconocida se expresan en el tejido neural y la exposición a warfarina in utero da como resultado retraso mental y anomalías faciales. Esto concuerda con la observación de que la expresión de VKD carboxilasa, la enzima que consigue la modificación de Gla, está regulada temporalmente de una manera específica de tejido con alta expresión en el sistema nervioso durante las fases embrionarias tempranas. De manera simultánea a la carboxilación, la vitamina K reducida, un cosustrato de la reacción, se convierte en vitamina K epóxido. Debido a que la cantidad de vitamina K en la dieta humana es limitada, la vitamina K epóxido debe convertirse de nuevo en vitamina K mediante la vitamina K epóxido reductasa (VKOR) para evitar su agotamiento. La warfarina, el fármaco anticoagulante más ampliamente usado, selecciona como diana la VKOR y evita la regeneración de la vitamina K. La consecuencia es una disminución en la concentración de vitamina K reducida, lo que da como resultado una tasa de carboxilación reducida mediante la ?-glutamil carboxilasa y la producción de proteínas dependientes de vitamina K infracarboxiladas.

En los Estados Unidos solo, se prescribe warfarina a más de un millón de pacientes al año y en Holanda, se ha notificado que aproximadamente el 2% de la población está recibiendo un tratamiento con warfarina a largo plazo. Debido a que la dosis de warfarina requerida para un nivel terapéutico de anticoagulación varía enormemente entre los pacientes, la utilización de warfarina va acompañada de un riesgo significativo de efectos secundarios. Por ejemplo, se ha notificado que tras el inicio del tratamiento con warfarina se producían episodios de hemorragias importantes en el 1-2% de los pacientes y se producía la muerte en el 0,1-0,7% de los pacientes. A pesar de los peligros, se ha estimado que el uso de warfarina puede prevenir 20 accidentes cerebrovasculares por episodio de hemorragia inducida y probablemente está utilizándose menos de lo debido por el miedo a la hemorragia inducida.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una célula transformada seleccionada de:

Preferiblemente, la célula transformada es o bien procariota o bien eucariota.

Un aspecto adicional de la invención es una célula que contiene y expresa un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa operativamente asociada a un promotor heterólogo.

Un aspecto adicional de la invención es un método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

Un aspecto aún adicional de la invención es un método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

Un aspecto aún adicional de la invención es un método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

Preferiblemente, en los métodos de la invención, el ácido nucleico que codifica para la proteína dependiente de vitamina K se selecciona del grupo que comprende factor VII, factor IX, factor X, protrombina, proteína C y proteína S.

Se describe también un método de preparación de una proteína dependiente de vitamina K que comprende cultivar una célula huésped que expresa un ácido nucleico que codifica para una proteína dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K y produce una proteína dependiente de vitamina K, y luego recoger la proteína dependiente de vitamina K del cultivo, conteniendo y expresando la célula huésped un ácido nucleico heterólogo que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K, y conteniendo y expresando además la célula huésped un ácido nucleico heterólogo que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) y que produce VKOR tal como se describe en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Para cada uno de los 13 conjuntos de ARNip, se transfectaron tres frascos T7 que contenían células A549 y se determinó la actividad VKOR tras 72 h. En el ensayo de VKOR se usó vitamina K epóxido 25 µM. Un conjunto de ARNip específico para el gen gi:13124769 redujo la actividad VKOR en un 64%-70% en ocho repeticiones.

Figura 2. Transcurso de tiempo de la inhibición de la actividad VKOR mediante el conjunto de ARNip específico para gi:13124769 en células A549. La actividad VKOR disminuyó de manera continua durante este periodo de tiempo mientras que el nivel de su ARNm disminuyó rápidamente hasta aproximadamente un 20% del normal. Se usó vitamina K epóxido 25 µM para este ensayo. El ARNip no afectó a la actividad de VKD carboxilasa o al nivel de ARNm de lamin A/C.

Figura 3. Se detectó actividad VKOR cuando se expresó mGC_11276 en células de insecto Sf9. Se usaron ~1X10⁶ células en este ensayo. Se realizaron las reacciones usando KO 32 µM a 30ºC durante 30 minutos en tampón D. Células Sf9 blanco sirvieron como control negativo y células A549 como referencia.

Figura 4. Inhibición de...

1. Célula transformada seleccionada de:

2. Célula transformada según la reivindicación 1, siendo la célula o bien procariota o bien eucariota.

3. Célula que contiene y expresa un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa operativamente asociada a un promotor heterólogo.

4. Método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

5. Método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

6. Método para mejorar la productividad de la expresión de proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped, que comprende las etapas de:

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en el que el ácido nucleico que codifica para la proteína dependiente de vitamina K se selecciona del grupo que comprende factor VII, factor IX, factor X, protrombina, proteína C y proteína S.