Organismo microbiano aislado y purificado, en donde dicho organismo microbiano es capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico,

y en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico, y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado: i) un índice de supervivencia que es al menos 1% después de dos días a 23ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 y comprendiendo al menos 12 vol% de etanol. ii) un índice de supervivencia que es al menos 70% después de dos días a 17ºC en un zumo de frutas fermentado estéril con un pH de menos de 4 comprendiendo al menos 13.9 vol% de etanol

Iniciación de fermentación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la iniciación de, al igual que a métodos de fermentación en una composición líquida comprendiendo un compuesto fermentable. En particular la invención se refiere a métodos y composiciones para la iniciación de la fermentación maloláctica durante la producción de vino.

Campo de la invención

El vino contiene ácido L-málico en la gama de 1 a 10 g/L. La cantidad de ácido málico depende en gran medida de las condiciones climáticas. Por lo tanto, los vinos producidos en zonas más frías tienden a tener una concentración relativa mayor. De un punto de vista de gusto y sabor, el ácido málico es considerado indeseable en la mayoría de los vinos tintos y en varios tipos de vinos blancos y vinos espumantes y desde un punto de vista práctico/económico el ácido málico es indeseable ya que puede ayudar al crecimiento de bacterias en el vino después de haber sido embotellado.

Durante la fermentación alcohólica sólo una pequeña parte del presente ácido málico es degradado por la levadura. No obstante, el contenido de ácido málico en un vino puede ser eficazmente reducido por la denominada fermentación maloláctica (FML) que ocurre normalmente después de la finalización de la fermentación alcohólica. La FML resulta de la actividad catabólica de varias bacterias del ácido láctico, incluyendo especies pertenecientes a los géneros de Lactobacillus, Pediococcus y Oenococcus.

Las bacterias pueden estar presentes en el vino como parte de la flora microbiana endógena, o pueden haber sido añadidas como un cultivo bacteriano iniciador. Las especies de bacterias más preferibles por los vinicultores son Oenococcus oeni, conocido anteriormente como Leuconostoc oenos. La fase catabólica es adentrada usualmente, cuando las bacterias malolácticamente activas durante la fase de crecimiento han alcanzado una densidad de población de aproximadamente 10⁶ unidades formadoras de colonias (UFC) por ml en el vino. Durante el FML las bacterias degradan el ácido málico, un ácido dicarboxílico, un ácido láctico, un ácido monocarboxílico. Como resultado de esto la acidez del vino disminuye y el pH aumenta, dando como resultado un vino con un paladar más suave. Dentro del campo, la fermentación maloláctica se considera completada cuando la concentración de ácido málico en el vino es inferior a 30 mg/l (Zoecklein et al., en Wine Analysis and Production, Chapman and Hall, p 296).

No obstante, durante la fermentación maloláctica la Oenococcus oeni también degrada el ácido cítrico, que normalmente está presente en el vino en una concentración de 0.3-0.9 g/l. El catabolismo del ácido málico y ácido cítrico en general no es concomitante, sino secuencial, es decir la degradación de ácido cítrico es retrasada en comparación con la fermentación de ácida málico (véase por ejemplo Nielsen et Al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65:740-745 and Viljakainen and Laakso, 2000, Eur. Food Res. Technol., 211:438-442). El grado de retraso depende de las bacterias específicas y del vino. La degradación de ácido cítrico a menudo es indeseada ya que el vino pierde algo de la frutosidad que es apreciada en la mayoría de los vinos. Otro efecto indeseado e inevitable de la degradación de ácido cítrico por Oenococcus oeni durante la FML es la producción de ácido acético, que es uno de los productos finales de la degradación del ácido cítrico. La concentración de ácido acético en el vino puede incrementarse con 0.1-0.3 g/l durante la FML. El ácido acético es altamente indeseado ya que da al vino un desagradable sabor a vinagre en concentración mayor y el vinicultor pone mucha atención en mantener la concentración de ácido acético en el vino lo más baja posible durante las diferentes fases de la vinificación. Aparte de las bacterias del ácido láctico las otras fuentes de ácido acético en la vinificación son levadura y bacterias del ácido acético. Un importante compuesto intermediario en el metabolismo del ácido cítrico por Oenococcus oeni es diacetilo. Cuando está presente en concentración superior al umbral sensorial, el diacetilo da al vino un aroma mantecoso que es indeseado en la mayoría de los vinos tintos. No obstante, en algunos vinos blancos, p. ej. el Chardonnay el aroma puede ser apreciado.

Como el vinicultor a menudo prefiere ejercer un grado mayor de control sobre el proceso de fermentación maloláctica se ha vuelto una práctica común cada vez más en la industria de los vinos el inducir la fermentación mediante el uso de cultivos iniciadores concentrados congelados o liofilizados disponibles comercialmente de Oenococcus oeni, que están inoculados directamente en el vino sin rehidratación previa ni etapa de activación alguna. La utilidad de un cultivo congelado concentrado o liofilizado que es inoculado directamente en el vino depende mucho del índice de supervivencia del cultivo de bacterias después de la inoculación. La transición de las bacterias de un medio de propagación fácil con pH alto y alto nivel de nutrición a la condición hostil en vino con concentración de etanol alta, pH bajo, bajo nivel de nutrición, y presencia de SO₂ es muy estresante para las bacterias y puede resultar en índices de supervivencia inferiores al 1% en el vino inoculado.

Típicamente, el medio de propagación que se describe para las bacterias del ácido láctico, incluyendo la Oenococcus oeni, contienen varios nutrientes tales como vitaminas, minerales, extracto de levadura y azúcares. La cantidad de azúcares en los medios normalmente están dentro de los 20-50 g/l ya que las concentraciones superiores de azúcares se considera que reducen o inhiben el crecimiento de las bacterias del ácido láctico. En la técnica anterior las concentraciones superiores de azúcares en el medio de propagación se han considerado por lo tanto, no ser de uso práctico o de interés económico.

Los cultivos liofilizados de una cepa de Oenococcus oeni, que no fermentan el ácido cítrico en el vino durante la fermentación maloláctica, están disponibles comercialmente. Hay varias ventajas de usar esta cepa para la fermentación maloláctica en vino. La frutosidad del vino es conservada, no hay producción de ácido acético durante la fermentación maloláctica y no hay producción del sabor mantecoso, el diacetilo. No obstante, los cultivos comerciales de esta cepa en el mercado no pueden ser usados para la inoculación directa en vino ya que esto resulta en un índice de supervivencia que no es de uso práctico. Según los manuales de aplicación comercial de los productos, los cultivos liofilizados necesitan rehidratación y un procedimiento de adaptación implicando varias etapas antes de que las bacterias puedan ser inoculadas en el vino. La primera etapa puede implicar la disolución del producto liofilizado en 5 L de mitad agua, mitad zumo de uva o vino añadido a diferente nutrición. Después de 5-7 días de incubación el precultivo es diluido con 20-200 L de vino que es incubado durante otros 2-12 días antes de la inoculación final en el tanque de producción con vino. Las etapas de adaptación conllevan mucho tiempo y trabajo para el vinicultor ya que tiene que seguir las etapas de adaptación cuidadosamente, y hay un alto riesgo de contaminación con las bacterias de deterioro y levadura ya que las etapas de adaptación bajo las condiciones prácticas en las vinificadoras no pueden ser llevadas a cabo bajo condiciones estériles.

WO 9320180 divulga un método para inducir la fermentación maloláctica en vino o zumo de frutas por la inoculación directa de un concentrado de un cultivo iniciador que contiene una cepa malolácticamente activa de bacterias seleccionada, con un índice de supervivencia de al menos 80% cuando es introducido en un vino con un pH de 3.2 o inferior y que contiene al menos 25 mg de SO₂ por cada L y al menos 12 vol% de etanol, y es capaz de iniciar la fermentación maloláctica cuando es añadida directamente al vino o zumo de frutas en una concentración de menos de 10⁷ unidades formadoras de colonias por cada ml. Dicha cepa de bacterias también es capaz de degradar ácido cítrico. El documento indica claramente que la habilidad de las cepas de bacterias de sobrevivir a la inoculación directa en vino está vinculada a la genética de la cepa seleccionada. Según la divulgación, las cepas seleccionadas de bacterias son propagadas...

1. Organismo microbiano aislado y purificado, en donde dicho organismo microbiano es capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico,

y en donde dicho organismo microbiano, cuando es colocado en un medio conteniendo una cantidad predeterminada de ácido cítrico sólo es capaz de degradar como mucho un 80% de dicho ácido cítrico,

y en donde el organismo microbiano tiene al menos una de las siguientes características, cuando dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente en un zumo de frutas fermentado:

2. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano es una cepa de Oenococcus oeni.

3. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que es al menos 10% después de dos días a 23ºC en un vino preparado por la fermentación de un zumo de frutas de uva estéril sin sulfito añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

4. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que está en la gama del 70% al 100% después de dos días a 18ºC en un vino preparado con 30 ppm de SO₂ añadido antes de la fermentación alcohólica, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.8 vol%, pH 3.5, 1.3 g/l de ácido málico, y 340 mg/l de ácido cítrico.

5. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde la característica es un índice de supervivencia que es al menos 80% después de dos días a 17ºC en un vino preparado sin SO₂ añadido, dicho vino que tiene un contenido de etanol de 13.9 vol%, pH 3.6, 1.7 g/l de ácido málico, y 320 mg/l de ácido cítrico.

6. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano cuando es colocado en una composición líquida comprendiendo una cantidad predeterminada de ácido málico es capaz de degradar al menos 90% de dicho ácido málico.

7. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano sólo es capaz de degradar como mucho el 50% de dicho ácido cítrico.

8. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo microbiano reduce el contenido de ácido cítrico en menos del 50% dentro de 50 días, cuando es añadido directamente en un estado congelado o liofilizado a un zumo de frutas fermentado en una concentración de UFCs en la gama de 1 x 10⁶ a 5 x 10⁷ por cada ml, en donde dicho zumo de frutas fermentado es preparado por la fermentación de un zumo de frutas estéril sin sulfito añadido resultando en un zumo de frutas fermentado que tiene un contenido de etanol de 12.0 vol%, pH 3.4, inferior a 5 g/l de azúcar residual, 3.3 g/l de ácido málico, y 450 mg/l de ácido cítrico.

9. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo es resistente a los bacteriófagos.

10. Organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho organismo retiene sus características durante la propagación y concentración.

11. Organismo microbiano según la reivindicación 1, en donde dicho organismo es seleccionado del grupo que consiste en cepas depositadas bajo los números de registro DSM 15569, DSM 15570, y DSM 15571.

12. Método de degradación preferentemente del ácido málico sobre el ácido cítrico en una composición líquida comprendiendo ácido málico y ácido cítrico, dicho método comprendiendo las etapas de

13. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida es zumo de uva o zumo de uva fermentado.

14. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida tiene un pH en la gama de 2 a 5.

15. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende etanol en la gama de 5 a 15 vol%.

16. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende ácido málico en la gama de 1 a 10 g/l.

17. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida comprende ácido cítrico en la gama de 50 a 2000 mg/l.

18. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida final comprende al menos 50% del ácido cítrico inicial.

19. Método según la reivindicación 12, en donde la composición líquida final comprende menos 20% del ácido málico inicial.

20. Método según la reivindicación 12, en donde el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10⁷ UFC por cada ml de la composición líquida.

21. Método según la reivindicación 13, en donde el zumo de uva fermentado es seleccionado del grupo que consiste en vinos tintos, vinos blancos y vinos espumantes.

22. Método según la reivindicación 12, en donde la fase iv) comprende la incubación durante un periodo temporal más largo que el requerido para completar la fermentación maloláctica.

23. Método de inducción de la fermentación maloláctica durante la producción de vino, comprendiendo las etapas de

24. Método según la reivindicación 23, en donde dicho organismo microbiano en un estado congelado o liofilizado es añadido directamente a dicho zumo de uva o un zumo de uva fermentado.

25. Método según la reivindicación 23, en donde el organismo microbiano es añadido en una concentración de menos de 5 x 10⁷ UFC por cada ml del zumo de uva o un zumo de uva fermentado.

26. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado tiene un pH en la gama de 2 a 5, tal como 3 a 4.

27. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende etanol en la gama de 5 a 15 vol%.

28. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende en la gama de 1 a 10 g/l.

29. Método según la reivindicación 23, en donde el zumo de uva o un zumo de uva fermentado comprende ácido cítrico en la gama de 50 a 2000 mg/l.

30. Método según la reivindicación 23, en donde el vino es seleccionado del grupo que consiste en vinos tintos, vinos blancos y vinos espumantes.

31. Concentrado de organismos microbianos comprendiendo o consistiendo en el organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho concentrado tiene un contenido de unidades formadoras de colonias estando en la gama de 10⁹ a 10¹² por cada g.

32. Concentrado según la reivindicación 31, en donde dicho organismo microbiano ha sido propagado en un medio de adaptación comprendiendo al menos 6% de azúcar

33. Concentrado según la reivindicación 32, en donde dicho medio de adaptación comprende al menos 3% de glucosa y al menos 3% de fructosa

34. Concentrado según la reivindicación 32, en donde dicho organismo microbiano ha sido propagado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas.

35. Método para producir un organismo microbiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho método comprende las fases de

36. Método según la reivindicación 35, en donde dicho organismo microbiano es resistente a pH 3.2.

37. Método según la reivindicación 35, en donde dicho organismo microbiano es resistente a una concentración de etanol de 13 vol%.

38. Método de preparación de un organismo microbiano seco capaz de fermentar ácido málico a ácido láctico, que tiene una actividad de degradación reducida del ácido cítrico y que es capaz de sobrevivir después de la inoculación directa en zumo de frutas fermentado, dicho método comprendiendo las etapas de

39. Método según la reivindicación 38, en donde dicho medio de adaptación comprende al menos 3% de glucosa y al menos 3% de fructosa.

40. Método según la reivindicación 38, en donde dicho organismo microbiano es propagado en dicho medio de adaptación durante al menos 12 horas.