Mejora del contenido aromático de vinos y otras bebidas alcohólicas mediante la utilización de microorganismos que,

durante la fermentación, producen monoterpeno sintasas.

La presente invención describe un nuevo procedimiento para elaborar bebidas alcohólicas con mayor y/o diferente contenido terpénico, mediante la utilización de microorganismos manipulados genéticamente para que expresen durante la fermentación genes que codifican monoterpeno sintasas (a veces llamadas monoterpeno ciclasas), lo que les capacita para producir de novo monoterpenos aromáticos a partir de cualquier material vegetal de partida. Los microorganismos son transformados con el gen Lis, que codifica una linalol sintasa, incrementándose la secreción de linalol, como ejemplo de una familia extensa de genes que codifican monoterpeno sintasas.

Aunque los microorganismos serán preferentemente levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, también sería aplicable a otros microorganismos de interés enológico tales como otras levaduras y ciertas bacterias. En particular, bebidas alcohólicas fermentadas tales como vinos, incluidos cava y champagne, cerveza, sidra, sake, etc. podrán tener un aroma más favorable o diferente

Mejora del contenido aromático de vinos y otras bebidas alcohólicas mediante la utilización de microorganismos que, durante la fermentación, producen monoterpeno sintasas.

Sector de la técnica

Sector vitivinícola. Se trata de dar solución al problema de los vinos (y eventualmente otras bebidas alcohólicas obtenidas por fermentación) con bajo contenido terpénico.

Estado de la técnica

El aroma de los vinos es una de las características más importantes en la valoración de su calidad. Se puede dividir en tres grandes grupos: (i) los aromas procedentes de la variedad de la uva o aromas primarios, producidos por sustancias volátiles, transferidas por los granos de la uva al mosto, fundamentalmente monoterpenos, que se pierden en gran parte durante el proceso; (ii) los aromas producidos durante la fermentación o aromas secundarios, entre los que se incluyen dos tipos de compuestos aromáticos mayoritarios, alcoholes superiores y ésteres; y (iii) el "bouquet", también conocido como aroma terciario, producido por la transformación final de los anteriores durante el envejecimiento.

El papel que juegan los monoterpenos - grupo muy variado de compuestos volátiles de bajo peso molecular - en el aroma afrutado y floral está bien definido (Williams et al., 1980) y variaciones cualitativas y cuantitativas en los mismos son responsables de matices varietales característicos (Marais, 1983). Más recientemente se ha establecido que algunos monoterpenos pueden además ser considerados como nutracéuticos (Crowell, 1999; Wise y Croteau, 1999; Croteau et al., 2000), por lo que la presencia de éstos podría ocasionar no sólo mejoras en las características organolépticas de los vinos sino también en sus características funcionales.

Los monoterpenos más abundantes en algunas variedades de uvas, y que en gran medida contribuyen al carácter varietal de los vinos, son linalol, geraniol, nerol a-terpineol y citronelol (Ribéreau-Gayon et al., 1975; Park et al., 1991). Éstos están presentes en dos fracciones distintas: una libre que contribuye al aroma, y otra ligada, formando diglicósidos no aromáticos, fundamentalmente 6-O-a-L-arabinofuranosil-ß-D-glucopiranósidos, 6-O-a-L-arabinopiranosil-ß-D-glucopiranósidos, 6-O-a-L-ramnopiranosil-ß-D-glucopiranósidos, 6-O-ß-D-xilopiranosil-ß-D-glucopiranósidos, 6-O-a-L-apiofuranosil-ß-D-glucopiranósidos y 6-O-ß-D-glucopiranosil-ß-D-glucopiranósidos, estando el aglicón siempre ligado a la ß-D-glucopiranosa (revisado en Günata, 2003). Esta segunda fracción es cuantitativamente superior a la primera (Günata et al., 1985a; 1985b), y apenas sufre cambios durante el proceso de fermentación llevado a cabo por Saccharomyces cerevisiae; por tanto supone una fuente potencialmente aprovechable para incrementar el aroma de los vinos. Se ha demostrado que la hidrólisis enzimática de estos compuestos precursores ocurre en dos etapas, en la primera la unión entre azúcares se rompe por la acción de una exoglicosidasa: una arabinofuranosidasa, una ramnosidasa, una ß-xilosidasa o una apiosidasa y posteriormente, mediante la acción de una ß-glucosidasa se libera el aglicón (normalmente un monoterpeno o un alcohol superior en menor medida) con capacidad aromática (Günata et al., 1988; 1990). Más recientemente se ha mostrado que la acción única de una exoglucanasa, al actuar como una endoglicosidasa, es suficiente para la liberación del monoterpeno (Gil et al., 2005).

Hasta ahora el uso enzimas de maceración, que facilitan la liberación de los precursores glicosídicos, y de glicosidasas, que facilitan la liberación del aglicón, tanto adicionadas al vino como producidas por la propia levadura que lleva a cabo la fermentación (revisado por Günata, 2003; Manzanares y Orejas, 2005; Ramón et al., 2005; Schuller y Casal., 2005; Verstrepen et al., 2006; así como protegido por varias patentes: Günata et al., 1989; Ramón et al., 1994; Rosi y Paolo 1996; Fowler et al., 1999; Vilanova de la Torre et al., 2004) es una de las estrategias ya descritas para incrementar el aroma del vino. No obstante, con esta estrategia sólo sería posible aumentar los componentes aromáticos de aquellos vinos procedentes de variedades de uva que tienen un nivel elevado de terpenos glicosilados, por ejemplo Moscatel; sin embargo la mayor parte de las variedades que se usan en vinificación, por ejemplo Palomino, Xarel.lo, Bobal etc., tienen un perfil aromático más neutro debido a la escasez de terpenos tanto en forma libre como glicosilada (López-Tamames et al., 1997; Gil y Vallés 2001; Estévez et al., 2004).

En estos casos, una alternativa a la adición de enzimas o la utilización de levaduras recombinantes que expresan dichas actividades, sería que la propia levadura que lleva a cabo la fermentación fuese capaz de sintetizar de novo monoterpenos como consecuencia de su metabolismo. En este sentido, aunque S. cerevisae normalmente no produce monoterpenos de forma natural, en un intento de obtener levaduras que los produjeran, se aislaron (tras mutagénesis con luz UV de la cepa de laboratorio FL100) dos mutantes autotróficos para ergosterol, de genotipo complicado, bloqueados en la enzima farnesil difosfato sintetasa, codificada por ERG20, y que además llevan mutaciones adicionales en otros genes de la ruta (erg12-2 y/o erg9, codifican mevalonato kinasa y escualeno sintasa respectivamente) que les permitían reducir los niveles de geraniol para sobrevivir; el mutante VL134 era capaz de excretar farnesol (0.220 mg/L) y geraniol (0.450 mg/L), producidos desde sus formas fosforiladas posiblemente por fosfatasas inespecíficas (Chambon et al., 1990a; 1990b). La habilidad de producir terpenos fue introducida en la cepa vínica L116 (Fermivin) por cruzamientos, y los mutantes descendientes del cruce eran capaces de producir grandes cantidades de algunos terpenos, incluso superiores que la cepa parental (hasta 6 ppm). Sin embargo, la capacidad de consumir glucosa y producir etanol era menor en todos los descendientes aislados, lo que les hacía inviables para determinadas aplicaciones tecnológicas (Javelot et al., 1991). Al igual que en el caso anterior, este método ha sido protegido por varias patentes (Karst et al., 1989; 1992; 1994, y Watanabe et al., 2002 para su utilización en Sake).

Más recientemente, Carrau et al. (2005) han descrito que algunas cepas vínicas diferentes a L116 eran capaces de producir monoterpenos en mosto sintético; en concreto la cepa KU1 (Uruguay) producía ~5 µg/L de linalol (cantidad que roza el umbral de detección, que es 4-10 ppb) y cantidades no detectables de otros monoterpenos como, por ejemplo geraniol. Sin embargo, en el mismo estudio, en otras cepas vínicas utilizadas industrialmente, Montrachet 522 (Universidad de California, Davis), CIVC8130 (Francia) y dos cepas uruguayas, el linalol producido estaba por debajo del umbral de detección.

Por otro lado, en las plantas los monoterpenos están presentes en los aceites esenciales de flores y frutas y son producidos, de manera específica, por las monoterpeno sintasas, que utilizan como sustrato geranil difosfato (GPP) (Bohlmann et al., 1998). Este sustrato es un metabolito común en microorganismos y en organismos superiores, lo que abre la posibilidad de aplicar técnicas de ingeniería metabólica para proporcionar a un determinado microorganismo nuevos pasos en la ruta de isoprenoides, que incluyan los genes que le faltan para la fabricación de un determinado monoterpeno (Carter et al., 2003 y Reiling et al., 2004 en Escherichia coli; Oswald et al., 2006 en cepas de laboratorio de S. cerevisiae). En los últimos diez años, distintos laboratorios han empezado a caracterizar los genes y enzimas responsables de la producción de los componentes específicos del aroma y del sabor de flores, frutas y verduras. Así, entre los genes cuyos productos determinan el olor de las flores de la especie Clarkia breweri, se ha caracterizado el gen Lis (Dudareva et al., 1996; patentado por Pichersky, 1997) que codifica la enzima S-linalol sintasa (LIS) y que cataliza la producción del monoterpeno S-linalol, uno de los componentes importantes del aroma de los vinos, en una única reacción desde el GPP. Puesto que en levaduras el GPP es un intermediario de la síntesis de ergosterol, en la presente invención se ha dotado a la cepa vínica S. cerevisiae T₇₃ (CECT 1894; Querol et al., 1992) con el gen Lis de C. breweri y se ha estudiado...

1. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas caracterizado por la utilización de microorganismos modificados para que expresen genes exógenos que codifican monoterpeno sintasas, preferentemente linalol sintasa, lo que les capacita para la producción de novo de monoterpenos.

2. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 1 caracterizado por que el microorganismo es una levadura de interés en enología.

3. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que la levadura pertenece preferentemente al siguiente grupo: Saccharomyces, Hanseniaspora (Kloeckera), Candida, Pichia, Metschnikowia, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces.

4. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizado por que la levadura es la especie Saccharomyces cerevisiae.

5. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 4 caracterizado por que el miroorganismo es S. cerevisiae YR64 transformado con la secuencia SEQ ID NO1(CECT 12032).

6. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 1 caracterizado por que el microorganismo es una bacteria de interés en enología.

7. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 1 y 6 caracterizado por que la bacteria pertenece preferentemente al siguiente grupo: Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus.

8. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el microorganismo incluye secuencias nucleotídicas que codifican una o varias monoterpeno sintasas, preferentemente linalol sintasas, geraniol sintasas, a-terpineol sintasas.

9. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 8 caracterizado por que el microorganismo incluye preferentemente la secuencia del gen Lis de C. breweri (SEQ ID NO1), que codifica una linafol sintasa o cualquier secuencia de nucleótidos análoga a ésta y que se expresa de manera funcional.

10. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según las reivindicaciones 8 y 9 caracterizado por que las actividades monoterpeno sintasa están codificadas en uno o varios microorganismos, utilizados conjuntamente o de manera aislada.

11. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que la bebida fermentada pertenece preferentemente al siguiente grupo: vinos (incluidos tanto no espumosos como cava, champagne y otros espumosos), cerveza, sidra, sake.

12. Procedimiento de elaboración de bebidas alcohólicas según la reivindicación 11, caracterizado por que la bebida fermentada es vino: vino blanco, tinto o rosado obtenido a partir de mostos de uva de cualquier variedad.