USO DE LEVADURAS MUTANTES URE2 PARA INCREMENTAR LA LIBERACION DE TIOLES VOLÁTILES AROMÁTICOS MEDIANTE LEVADURA DURANTE LA FERMENTACIÓN.

Uso de una levadura mutante URE2 que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación.

Uso de levaduras mutantes URE2 para incrementar la liberación de tioles volátiles aromáticos mediante levadura durante la fermentación La reacción se refiere al uso de levaduras mutantes URE2 para incrementar la liberación de tioles volátiles aromáticos mediante levadura durante la fermentación y su aplicación para mejorar el aroma de productos fermentados, en particular bebidas alcohólicas producidas mediante fermentación de levaduras (vino, sidra, cerveza), así como para desarrollar cepas iniciadoras de levaduras con capacidades de liberación de tiol volátil optimizadas. Los tioles volátiles son moléculas extremadamente aromáticas que pueden afectar el aroma de numerosas comidas tales como frutas y carne a la brasa (Shankaranarayana et al., Sulphur compounds in flavours. In Food Flavors; Morton, I.D., Macleod, A.J., Eds; Elsevier Science Publishers: Amsterdam, 1982; part A, p. 169-281). Diversos compuestos de esta familia juegan un papel decisivo en la contribución al aroma de vinos preparados a partir de la variedad de uva Sauvignon blanc (Tominaga et al., J. Agric. Food Chem., 1998c, 46: 5215-5219). Su contribución aromática también se demostró sucesivamente en otras variedades de uva diversas tales como Gewurztraminer, Semillon botritizado, Colombard, Petit-manseng (Tominaga et al., Am. J. Enol. Vitic., 2000a, 51, 178-181) y Merlot (Aznar et al., J. Agric. Food Chem., 2000, 49, 2924-2929). Entre estos compuestos, 4-mercapto-4metilpentan-2-ona (4MMP) (Darriet et al., Flavour Fragr. J., 1995, 10, 385-392; Tominaga et al., 1998c, citado previamente) y 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) (Tominaga et al., Flavour Fragr. J., 1998a, 13, 159-162) se forman principalmente durante la fermentación alcohólica a partir de precursores conjugados de S-cisteína no volátiles inodoros presentes en el mosto (Tominaga et al., J. Int. Sci. Vigne Vin., 1995, 29, 227-232; Tominaga et al., 1998a). La transformación de tales precursores en tioles volátiles se 20 logra mediante metabolismo de levaduras e implica una actividad carbono-azufre ß-liasa (Tominaga et al., 1998c ; Wakabayashi et al., J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 110-116). El acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA o A3MH) resultante de la acetilación de 3MH mediante levadura también contribuye al aroma del vino.   4MMP, 3MHA y 3MH están caracterizados por descriptores afrutados (boj, maracuyá y pomelo, respectivamente) y presentan umbrales de percepción muy bajos (0,8, 4,2, y 60 ng l-1, respectivamente; Tominaga et al., 1998a). Además, 3MH y 3MHA son moléculas quirales con 2 enantiómeros, R y S. En el vino blanco seco preparado a partir de uvas sanas, 3MH es casi racémico (relación R y S alrededor de 50:50), mientras que 3MHA está mayormente en la forma S (relación R y S alrededor de 30:70). En los vinos preparados a partir de uvas botritizadas (Botrytis cinerea), la distribución de enantiómeros de 3MH es de 30:70 a favor de la forma S. Se demostró recientemente que los enantiómeros 3MH(R) y 3MH(S) producían matices aromáticos diferentes (pomelo y maracuyá, respectivamente) con umbrales de percepción similares en solución hidroalcohólica modelo (50 y 60 ng l, respectivamente). Los umbrales de percepción de los enantiómeros R y S de 3MHA son ligeramente diferentes (9 y 2,5 ng/l): la forma R menos odorífera es reminiscente de maracuyá, mientras que la forma S tiene un olor más herbáceo de boj (Tominaga et al., J. Agric. Food. Chem., 2006, 54, 7251-7255). Las poderosas propiedades aromáticas de estas moléculas impulsaron estudios recientes para entender cómo puede potenciarse y modularse su producción en la vinificación. Prácticas vitícolas tales como el suministro de nitrógeno (Chone et al., J. Int. Sci. Vigne Vin., 2006, 40, 1-6) y operaciones de prefermentación tales como la maceración pelicular (Peyrot des Gachons et al., Am. J. Enol., Vitic., 2002, 53, 144-156) modulan la cantidad de precursores aromáticos en el mosto de uva. Las condiciones de la fermentación tales como la temperatura (Howell et al., FEMS Microbiol. Letter, 2004, 240, 125-129; Masneuf-Pomarede et al., Int J. Food Microbiol., 2006, 108, 385-390) también influencian la concentración final de estos aromas en el vino. Sin embargo, el factor más importante en la liberación de tiol es indudablemente la cepa de levaduras (Dubourdieu et al., Am. J. Enol. Vitic., 2006, 57, 81-88). Se encontró una fuerte variabilidad (aproximadamente de diez veces) entre las cepas iniciadoras de vino industrial de S. cerevisiae (Murat et al., 2001, Am. J. Enol., 52, 136-140; Howell et al., 2004, citado previamente; Masneuf-Pomarede et al., Int. J. Food Microbiol., 2006, 108, 385-390), S. uvarum, e híbridos interespecíficos relacionados (Masneuf et al., J. Int. Sci. Vigne Vin, 2002, 36, 205-212). Esta variabilidad indujo programas de rastreo y cría de cepas para obtener nuevas cepas que tienen liberación de tiol más alta (Murat et al., 2001; Masneuf et al., 2002, citado previamente). Sin embargo, sigue sin estar claro el determinismo genético y los mecanismos moleculares de la liberación de tiol mediante levadura. Recientemente, Howell et al. identificaron tres genes BNA3, CYS3 y IRC7 que codifican ß-liasa putativa en el genoma de Saccharomyces cerevisiae. Usando experimentos de deleción de gen en un precedente de cepas de levadura de vino, se sugiere que estas enzimas pueden escindir el precursor de 4MMP en aroma volátil relacionado durante la fermentación en el zumo de uva sintético (Howell et al., Applied Environ. Microbiology, 2005, 71, 5420-5426): Entre estos genes, se encontró que BNA3 que codifica para una arilformamidasa contribuye fuertemente a la liberación de tiol volátil. Aunque se han identificado estas enzimas, los mecanismos de escisión y asimilación de precursores mediante levaduras durante la fermentación están lejos de entenderse bien. Ure2p es un regulador transcripcional de genes implicado en el metabolismo de nitrógeno en levadura que actúa como regulador negativo de los genes sensibles a la represión por catabolito de nitrógeno (NCR) (Cooper, T. G. y Sumrada, R.A., J. Bacteriol., 1983, 155, 623-627; Coschinago, P.W. y Magasanik, B., Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 822-832; Ter Schure et al., FEMS Microbiol. Reviews, 2000, 24, 67-83; Magasanik, B., P.N.A.S., 2005, 102, 16537-16538; Cooper T., 1982, Transport in Saccharomyces cerevisiae. En The molecular biology of yeast Saccharomyces metabolism and gene 60 expression. Strathern, J.N., Laboratory CSH, Eds, pp. 399-461). La represión por catabolito de nitrógeno (NCR) es el mecanismo por el que una levadura puede seleccionar fuentes de nitrógeno permitiendo el mejor crecimiento (fuente de nitrógeno, fuente buena en nitrógeno o fuente rica en nitrógeno preferidas: glutamato, glutamina, amoniaco y 2 asparragina)   sobre las fuentes de nitrógeno no preferidas (fuente pobre en nitrógeno: urea, gamma-amino-butirato, aminoácidos tales como prolina y arginina), mediante la represión de la transcripción de algunos genes (genes sensibles a NCR) implicados en la utilización (transporte: permeasas; degradación: enzimas catabólicas) de las fuentes más pobres en nitrógeno (Cooper y Sumrada, citado previamente). Bajo condiciones ricas en nitrógeno (condiciones represivas), Ure2p forma complejos con Gln3p y Gatlp, activadores transcripcionales de la familia GATA, en el citoplasma, para disminuir la transcripción de genes que codifican las proteínas necesarias para el transporte y la degradación de las fuentes pobres en nitrógeno (NCR-sensitive expression; Ter Schure et al., citado previamente; Scherens et al., FEMS Yeast Res., 2006, 6, 777-791). Por otro lado, si sólo están disponibles fuentes de nitrógeno no preferidas, Gln3p y Gatlp están desfosforilados y se mueven desde el citoplasma al núcleo, en el que regulan positivamente la expresión de genes sensibles a NCR para el transporte y el catabolismo de nitrógeno. El control de la represión catabólica de nitrógeno es eficaz durante la fermentación de vino (Rossignol et al., Yeast, 2003, 20, 1369- 1385; Beltran et al., FEMS Yeast Res., 2004, 4, 625-632) y puede eliminarse mediante deleción del gen URE2. Tal deleción mejora la captación de nitrógeno lo que conduce a una mejora en la cinética de la fermentación bajo condiciones enológicas (Salmon, J.M. y Barre P., Applied and Environ. Microbiol., 1998, 64, 3831-3837; I.S. Pretorius, Yeast, 2000, 16, 675-729). Ure2p presenta un pliegue de GST que contiene un dominio de pliegue de tiorredoxina N-terminal y un dominio alfa helicoidal C-terminal. Un cambio conformacional transmisible de Ure2p da como resultado un prión denominado [Ure3], un amiloide infeccioso, autopropagante e inactivo. El dominio de pliegue de tiorredoxina N-terminal (N-terminal ~ 90 aminoácidos) es suficiente para inducir el fenotipo [Ure3] y también se denomina el dominio de priones de Ure2p (Masison... [Seguir leyendo]

1. Uso de una levadura mutante URE2 que tiene una mutación de pérdida de función en el gen URE2 para incrementar la liberación de tiol volátil aromático mediante levadura durante la fermentación. 2. Uso de la reivindicación 1, en el que el mutante es un mutante nulo que carece de función Ure2p. 3. Uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el mutante es un mutante de Saccharomyces sp. o de un híbrido interespecífico derivado. 4. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el mutante es un mutante de una cepa de levadura de vino. 5. Uso de la reivindicación 4, en el que la cepa de levadura de vino se selecciona del grupo constituido por: VL3c, X5 y RX60. 6. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tiol volátil aromático deriva de un precursor conjugado con S-cisteína. 7. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tiol volátil se selecciona del grupo constituido por: 4mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), 3-mercaptohexan-1-ol (3MH), 4-mercapto-4-metilpentan-2-ol (4MMPOH), acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA), 3-mercaptopentan-1-ol (3MPOH), 3-mercaptoheptan-1-ol (3MHepOH), 3mercapto-2-metilbutan-1-ol (3M2MBOH) y/o 3-mercapto-2-metilpentan-1-ol (3M2MPOH). 8. Uso de la reivindicación 7, en el que el 3MH que se libera mediante el mutante consiste de más enantiómero (R) que enantiómero (S). 9. Uso de la reivindicación 8, en el que el 3MH consiste de al menos el 70% de enantiómero (R). 10. Uso se cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la liberación de tiol volátil se incrementa al menos por un factor de 3. 11. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la fermentación es fermentaciónalcohólica. 12. Uso de la reivindicación 11, en el que el producto fermentado es una bebida alcohólica tal como vino. 13. Uso de la reivindicación 12, en el que el vino se prepara mediante fermentación de una variedad de uva no floral o simple seleccionada del grupo constituido por: Sauvignon blanc, Gewurztraminer, Riesling, Semillon, Colombard, Scheurebe, Petit Manseng, Cabernet Sauvignon y Merlot. 14. Procedimiento para potenciar el aroma de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene al menos un precursor de tiol no volátil, que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación de tiol(es) volátil(es) mediante la levadura mutante, durante la fermentación. 15. Procedimiento para potenciar el armónico de pomelo de un producto fermentado producido mediante fermentación de un producto inicial que contiene S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína (precursor de 3MH), que comprende la incubación del producto inicial con una levadura mutante URE2 tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el mutante URE2 se produzca y, por tanto, que incremente la liberación del enantiómero 3MH (R), mediante la levadura mutante, durante la fermentación. 16. Procedimiento para la identificación de levaduras que pueden mejorar el aroma de un producto fermentado, que comprende al menos las etapas de: (a) obtención de levaduras mutantes URE2, (b) inoculación del/de los mutante(s) URE2 de la etapa (a) en un medio de fermentación que contiene precursor(es) de tiol(es) no volátil(es), bajo condiciones que permiten que la fermentación mediante el/los mutante(s) 40 URE2 se produzca y, por tanto, que libere el/los tiol(es) volátil(es) mediante el mutante, durante la fermentación,   (c) medida del/de los tiol(es) volátil(es) liberado(s) en el medio fermentado, mediante cualquier medio apropiado y (d) identificación del/de los mutante(s) URE2 que puede(n) liberar alto nivel de tiol volátil, en comparación con levadura que tiene un gen URE2 de tipo salvaje en un precedente genético casi isogénico. 19   FIGURA 1 A   >ts URE2 Chr 14 desde 219511 hasta 219856 B >mutante URE2 Chr 14 desde 219511 hasta 219856 FIGURA 2 21