Amplificación múltiplex de locus de repeticiones cortas en tándem.

Método para identificar simultáneamente los alelos presentes en un conjunto de locus de una o más muestrasde ADN,

que comprende:

(a) proporcionar una muestra de ADN a analizar,

(b) seleccionar un conjunto de locus de la muestra de ADN, que comprende los locus de repeticiones 5 cortas entándem D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1PO, HUMFIBRA,HUMTH01, HUMTPOX y HUMvWFA31;

(c) coamplificar los locus en el conjunto en una reacción de amplificación múltiplex, en la que el producto de lareacción es una mezcla de alelos amplificados de cada uno de los locus coamplificados en el conjunto; y

(d) evaluar los alelos amplificados en la mezcla para determinar los alelos presentes en cada uno de los locusanalizados en el conjunto dentro de la muestra de ADN;

en el que la reacción de amplificación múltiplex es una reacción en cadena de la polimerasa.

Amplificación múltiplex de locus de repeticiones cortas en tándem

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de forma general a la detección de marcadores genéticos en un sistema genómico.

La presente invención se refiere más específicamente a la amplificación simultánea de varios locus genéticos polimórficos bien definidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa para determinar, en una reacción, los alelos de cada locus contenidos dentro del sistema múltiplex.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La tipificación por ADN se utiliza habitualmente para identificar la ascendencia de niños humanos y para confirmar el

linaje de caballos, perros, otros animales y cultivos agrícolas. La tipificación por ADN también se emplea habitualmente para identificar el origen de la sangre, de la saliva, del semen y de otros tejidos hallados en la escena de un crimen u otros sitios que requieren la identificación de restos humanos. La tipificación por ADN también se emplea en el entorno clínico para determinar el éxito o el fracaso del trasplante de la médula ósea y la presencia de determinados tejidos cancerosos. La tipificación por ADN implica el análisis de alelos de ADN genómico con características de interés, que se suelen denominar «marcadores». La mayor parte de los métodos de tipificación en uso hoy en día están diseñados específicamente para detectar y analizar diferencias de longitud y/o de secuencia de una o más regiones de los marcadores de ADN que se sabe que aparecen en al menos dos formas diferentes en una población. Tal variación de longitud y/o de secuencia se denomina «polimorfismo». Cualquier región (a saber, «locus») de ADN en la que se produce tal variación se denomina un «locus polimórfico». Los métodos y materiales de la presente invención están diseñados para su uso en la detección de varios locus de ADN, algunos de los cuales, o todos, son locus polimórficos.

Se llevan buscado desde hace tiempo marcadores genéticos que sean suficientemente polimórficos respecto a la longitud o a la secuencia para usarlos en aplicaciones de identidad, tales como las pruebas de paternidad y la identificación de muestras de tejido recogidas para análisis forense. El descubrimiento y el desarrollo de tales marcadores y los métodos para analizar tales marcadores han pasado por varias fases de desarrollo durante los últimos años.

Los primeros marcadores de variantes del ADN identificados eran simples sustituciones de base, a saber, polimorfismos simples de las secuencias, que se detectaban la mayor parte de las veces mediante ensayos de hibridación por transferencia de tipo Southern. Para los ejemplos de referencias que describen la identificación de tales marcadores, diseñados para ser utilizados en el análisis del ADN digerido con endonucleasas de restricción mediante sondas radioactivas, véase: Southern, E. M. (1975) J. Mol. Biol. 98 (3) : 503-507; Schumm et al. (1988) American Journal of Human Genetics 42: 143-159; y Wyman, A. y White, R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 6754-6758.

La siguiente generación de marcadores eran variantes de tamaño, a saber, polimorfismos de longitud,

específicamente marcadores por el «número variable de repeticiones en tándem» (VNTR, por su nombre en inglés) (Nakamura Y., et al. (1987) Science 235: 1616-1622; y patente de los EE.UU. n.º 4 963 663 de White et al (1990) ; patente de los EE.UU. n.º 5 411 859 continuación de la 4 963 663 expedida a Whilte et al (1995) ) y marcadores basados en «minisatélites» (Jeffreys et al., (1985a) , Nature 314: 67-73; Jeffreys et al. (1985b) Nature 316: 76-79; patente de los EE.UU. n.º 5 175 082 para una invención de Jeffreys) . Las VNTR y los marcadores basados en minisatélites contienen regiones de secuencias casi idénticas repetidas en tándem. El núcleo de la secuencia repetida tiene de 10 a 70 bases de longitud, con lo que se denominan repeticiones «minisatélite» si el núcleo de la secuencia repetida es pequeño y VNTR si las repeticiones son largas. Los diferentes individuos de una población humana contienen un número diferente de repeticiones. Los marcadores basados en VNTR son por lo general mucho más polimórficos que los polimorfismos por sustitución de base, y a veces muestran hasta cuarenta o más 45 alelos en un solo locus genético. Sin embargo, para detectar y analizar la mayoría de estos marcadores todavía siguen siendo necesarios el proceso tedioso de la digestión con enzimas de restricción y el posterior análisis por hibridación de tipo Southern.

El siguiente avance implicó el encuentro de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su nombre en inglés) (patente de los EE.UU. n.º 4 683 202 de Mullis, K. B.) con el análisis de los locus de las VNTR 50 (Kasai, K et al., (1990) Journal Forensic Science 35 (5) : 1196-1200) . Se descubrieron locus de VNTR amplificables, que se podían detectar sin necesidad de transferencia Southern. Los productos amplificados se separan en geles de agarosa o de poliacrilamida y se detectan mediante la incorporación de radioactividad durante la amplificación o mediante la tinción posterior con plata o con bromuro de etidio. Sin embargo, la PCR se puede utilizar solamente para amplificar segmentos de ADN relativamente pequeños de manera fiable, a saber, sólo se amplifican de forma 55 fiable los segmentos de ADN de menos de 3000 bases de longitud (Ponce, M y Micol, L. (1992) NAR 20 (3) : 623; Decorte R et al., (1990) DNA Cell Biol. 9 (6) : 461-469) . Por consiguiente, se han desarrollado muy pocas VNTR amplificables.

En los últimos años, el descubrimiento y el desarrollo de las repeticiones cortas en tándem (STR, por su nombre en inglés) polimórficas como marcadores genéticos ha estimulado el progreso del desarrollo de mapas de ligamiento, la identificación y la caracterización de genes de enfermedades, y la simplificación y la precisión de la tipificación por ADN. Específicamente, con el descubrimiento y el desarrollo de marcadores polimórficos que contienen repeticiones 5 dinucleotídicas (Litt y Luty (1989) Am J. Hum. Genet. 3 (4) : 599-605; Tautz, D (1989) NAR 17: 6463-6471; Weber y May (1989) Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396; patente alemana n.º DE 38 34 636 C2, inventor Tautz, D; patente de los EE.UU. n.º 5 582 979 registrada por Weber, L.) , STR con unidades de repetición de tres a cuatro nucleótidos (Edwards, A., et al., (1991) Am. J. Hum. Genet. 49: 746-756; Hammond, H. A., et al., (1994) , Am. J. Hum. Genet. 55: 175-189; Fregeau, C. J. y Fourney, R. M. (1993) BioTechniques 15 (1) : 100-119; Schumm, J. W. et al., (1994) en 10 The Fourth International Symposium on Human Identification 1993, págs. 177-187 (pub. de Promega Corp., 1994) ; y patente de los EE.UU. n.º 5 364 759 de Caskey et al.; patente alemana n.º DE 38 34 636 C2 de Tautz, D.) y las STR con unidades de repetición de cinco a siete bases (véase, p. ej., Edwards et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4791; Chen et al., (1993) Genomics 15 (3) : 621-5; Harada et al., (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175-189; Comings et al., (1995) , Genomics 29 (2) : 390-6; y el Grupo de Desarrollo de Marcadores de Utah (1995) Am. J. Genet. 57: 619-628;

y Jurka y Pethiyagoda (1995) J. Mol. Evol. 40: 120-126) ) , se han solucionado muchas de las deficiencias de los métodos anteriores. Los marcadores basados en STR son por lo general más cortos que los marcadores basados en VNTR, lo que los convierte en mejores sustratos para la amplificación que la mayoría de los marcadores basados en VNTR.

Los locus de las STR se parecen a los locus de las VNTR amplificables en que los alelos amplificados en cada locus se pueden diferenciar basándose en la variación de la longitud. En términos generales, los locus de las STR son menos polimórficos en cada locus individual que los locus de las VNTR. Por lo tanto, es deseable amplificar y detectar varios sistemas de STR en una sola reacción de amplificación y separación que proporcionen información de varios locus a la vez. Los sistemas que contienen varios locus se llaman sistemas múltiplex y se ha descrito que muchos de estos sistemas contienen hasta 11 locus de STR diferentes. Véase, p. ej., Proceedings: American Academic of Forensic Sciences (9-14 de febrero de 1998) , Schumm, James W et al., pág. 53, B88; Id., Gibson, Sandra D. et al., pág. 53, B89; Id., Lazaruk, Katherine et al., pág. 51, B83; Sparkes, R et al., Int. J. Legal Med. (1996)

109: 186-194; AmpFtSTR ProfilerTM PCR Amplification Kit User's Manual (1997) pub. de Perkin-Elmer Corp., i-viii y 1-1 a 1-10; AmpFtSTR Profiler PlusTM PCR Amplification Kit User's Manual (1997) , pub. de Perkin-Elmer Corp., i-viii y 1-1 a 1-10; AmpFtSTR COfilerTM PCR Amplification... [Seguir leyendo]

1. Método para identificar simultáneamente los alelos presentes en un conjunto de locus de una o más muestras de ADN, que comprende:

(a) proporcionar una muestra de ADN a analizar,

(b) seleccionar un conjunto de locus de la muestra de ADN, que comprende los locus de repeticiones cortas en tándem D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, HUMCSF1PO, HUMFIBRA, HUMTH01, HUMTPOX y HUMvWFA31;

(c) coamplificar los locus en el conjunto en una reacción de amplificación múltiplex, en la que el producto de la reacción es una mezcla de alelos amplificados de cada uno de los locus coamplificados en el conjunto; y

(d) evaluar los alelos amplificados en la mezcla para determinar los alelos presentes en cada uno de los locus analizados en el conjunto dentro de la muestra de ADN;

en el que la reacción de amplificación múltiplex es una reacción en cadena de la polimerasa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la reacción de amplificación múltiplex se realiza utilizando al menos un cebador para al menos un locus del conjunto de al menos trece locus seleccionados en la etapa (b) , en el 15 que el cebador tiene una secuencia seleccionada entre uno de los grupos de las secuencias de cebadores que consiste en: SEQ ID n.º 62, SEQ ID n.º 63, SEQ ID n.º 101 y SEQ ID n.º 102, cuando uno de los locus del conjunto es D18S51; SEQ ID n. 64 y SEQ ID n.º 65 para el locus D21S11; SEQ ID n.º 37, SEQ ID n.º 38, SEQ ID n.º 66, SEQ ID n.º 67 y SEQ ID n.º 103, para el locus HUMTH01; 20 SEQ ID n.º 68, SEQ ID n.º 69 y SEQ ID n.º 106, para el locus D3S1358; SEQ ID n.º 70, SEQ ID n.º 71 y SEQ ID n.º 107, para el locus HUMFIBRA; SEQ ID n. 35, SEQ ID n.º 36, SEQ ID n.º 72 y SEQ ID n.º 73, para el locus HUMTPOX; SEQ ID n.º 74, SEQ ID n.º 75 y SEQ ID n.º 104, para el locus D8S1179; SEQ ID n.º 39, SEQ ID n.º 40, SEQ ID n.º 59, SEQ ID n.º 60 y SEQ ID n.º 76, para el locus HUMvWFA31; 25 SEQ ID n.º 33, SEQ ID n.º 34, SEQ ID n.º 77, SEQ ID n.º 78 y SEQ ID n.º 98, para el locus HUMCSF1PO; SEQ ID n.º 29, SEQ ID n.º 30, SEQ ID n.º 58, SEQ ID n.º 79 y SEQ ID n.º 97, para el locus D16S539; SEQ ID n.º 1, SEQ ID n.º 2, SEQ ID n.º 80 y SEQ ID n.º 81, para el locus D7S820;

SEQ ID n.º 3, SEQ ID n.º 4, SEQ ID n.º 82 y SEQ ID n.º 83, para el locus D13S317; y SEQ ID n.º 5, SEQ ID n.º 6, SEQ ID n.º 84 y SEQ ID n.º 85, para el locus D5S818.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de locus seleccionados en la etapa (a) del método comprende adicionalmente al menos un locus adicional seleccionado entre el grupo de locus que consiste en: G475, S159, C221 y Amelogenina.

4. Método según la reivindicación 3, en el que la reacción de amplificación múltiplex se realiza utilizando al menos un cebador oligonucleotídico que tiene una secuencia seleccionada entre al menos uno de los grupos de 35 secuencias que consisten en:

SEQ ID n.º 88, SEQ ID n.º 89 y SEQ ID n.º 94, cuando uno de los locus del conjunto es G475; SEQ ID n.º 90, SEQ ID n.º 91, SEQ ID n.º 92, SEQ ID n.º 93, SEQ ID n.º 95 y SEQ ID n.º 96, cuando uno de los locus del conjunto es S159;

SEQ ID n.º 99 y SEQ ID n.º 100, cuando uno de los locus del conjunto es C221; y 40 SEQ ID n.º 86, SEQ ID n.º 87 y SEQ ID n.º 105, cuando uno de los locus del conjunto es el locus de la Amelogenina.

5. Método según la reivindicación 1, en el que los alelos amplificados se evalúan comparando los alelos amplificados con un patrón de tamaños, en el que el patrón de tamaños se selecciona entre el grupo de patrones de

tamaños que consiste en un marcador de ADN y una escalera alélica específica de locus.

6. Método según reivindicación 1, en el que la muestra de ADN a analizar se ha preparado a partir de tejido humano, en el que el tejido humano se selecciona entre el grupo de tejido humano que consiste en sangre, semen, células vaginales, cabello, saliva, orina, hueso, muestra oral, líquido amniótico que contiene células de la placenta o

células fetales, y mezclas de cualquiera de los tejidos que se acaban de enumerar.

Amplificación con plantilla deADN

Escaneo a 505 nm: canal de la fluoresceína Muestra 1 Muestra 2

Escaneo a 505 nm: canal de la fluoresceína Muestra 1 Muestra 2

Escaneo a 505 nm: canal de la fluoresceína Muestra1 Muestra 2