Materiales y métodos para identificar y analizar marcadores de ADN de repeticiones intermedias en tándem.

Un método para detectar una secuencia de ADN objetivo de repeticiones intermedias en tándem que tiene una incidencia baja de artefactos por tartamudeo,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de ADN que tiene al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem es una región del ADN que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete (7) pares de bases repetidas en tándem al menos dos (2) veces; y

(b) detectar la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem en la muestra de ADN, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem de la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) se amplifica antes de la etapa (b), y en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem se amplifica mediante el uso de al menos un cebador oligonucleotídico, que comprende una secuencia que es complementaria y que flanquea a una región de un marcador de ADN bicatenario que contiene una secuencia molde de repeticiones intermedias en tándem, en la que la secuencia molde de repeticiones intermedias en tándem es una región del marcador de ADN que contiene la secuencia de unidades de repetición repetidas en tándem al menos dos (2) veces,

con tal de que el marcador de ADN tenga la secuencia SEQ ID Nº:26.

Materiales y mïtodos para identificar y analizar marcadores de ADN de repeticiones intermedias en tïndem.

Campo de la invenciïn En la presente memoria se describe la identificaciïn y el anïlisis de marcadores genïticos en un sistema genïmico.

De manera mïs especïfica, en la presente memoria se describe la identificaciïn de loci en el ADN, en particular en el ADN genïmico, que contienen polimorfismos de longitud debido a variaciones en el nïmero de repeticiones de secuencias intermedias (5 a 7 bases) . En la presente memoria se describe la detecciïn de tales loci polimïrficos. En la presente memoria se describen mïtodos para identificar y distinguir individuos basïndose principalmente en las diferencias de tamaïos de los productos de amplificaciïn del ADN genïmico en tal locus, en los que el nïmero de secuencias de repeticiones intermedias en tïndem varïan de un individuo a otro.

Antecedentes de la invenciïn La tipificaciïn del ADN se utiliza habitualmente para identificar la ascendencia de niïos humanos, y para confirmar el linaje de caballos, perros, y otros animales de competiciïn. La tipificaciïn del ADN tambiïn se emplea habitualmente para identificar el origen de la sangre, saliva, semen y otros tejidos hallados en la escena de un crimen. Los mïtodos 15 de tipificaciïn del ADN actualmente en uso estïn diseïados para detectar y analizar diferencias de longitud y/o de secuencia de una o mïs regiones del ADN que se sabe que aparecen en al menos dos formas diferentes en una poblaciïn. La tipificaciïn del ADN se emplea tambiïn en el ïmbito clïnico para determinar el ïxito o el fracaso del transplante de mïdula ïsea y la presencia de tejidos cancerosos particulares. Tal variaciïn de longitud y/o secuencia se denomina "polimorfismo". Cualquier regiïn (es decir, "locus") de ADN en la que se da tal variaciïn se denomina "locus polimïrfico". La mayorïa de las tïcnicas de tipificaciïn del ADN emplean al menos un "marcador" que contiene al menos dicho locus polimïrfico. Cada marcador individual contiene un ïnico alelo de ADN genïmico derivado en ïltima instancia de un ïnico individuo de una poblaciïn. Los mïtodos y materiales de la presente invenciïn estïn diseïados para el uso en la detecciïn de una clase particular de polimorfismos en el ADN caracterizados principalmente por la variaciïn de la longitud.

Durante mucho tiempo se han buscado marcadores genïticos que sean suficientemente polimïrficos con respecto a la longitud o la secuencia para el uso en las aplicaciones de identificaciïn, tales como pruebas de paternidad e identificaciïn de muestras de tejidos recogidas para el anïlisis forense. El descubrimiento y el desarrollo de tales marcadores y mïtodos para analizar tales marcadores ha atravesado varias fases de desarrollo a lo largo de los ïltimos aïos. En aïos recientes, el descubrimiento y el desarrollo de las repeticiones cortas en tïndem (STRs)

polimïrficas como marcadores genïticos ha estimulado el progreso en el desarrollo de la cartografïa de ligamiento, la identificaciïn y la caracterizaciïn de genes afectados por enfermedades, y la simplificaciïn y precisiïn de la tipificaciïn del ADN. La expresiïn "repeticiïn corta en tïndem" o "STR", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a todas las secuencias con una longitud de entre dos y siete nucleïtidos que estïn repetidas perfectamente,

o casi perfectamente en tïndem en el ADN genïmico de cualquier organismo. Vïase, por ejemplo, la definiciïn de "repeticiïn corta en tïndem" aplicada al ADN genïmico humano en la pat. de EE.UU. Nï 5.364.759, columna 4, lïnea 58 y sigs.

Los primeros marcadores de variantes del ADN identificados fueron sustituciones de bases simples, es decir, polimorfismos de secuencias simples, que se detectaban la mayor parte de las veces mediante ensayos de hibridaciïn de Southern. Para ejemplos de referencias que describen la identificaciïn de tales marcadores,

diseïados para ser usados para analizar el ADN digerido con endonucleasas de restricciïn con sondas radioactivas, vïase: Southern, E. M. (1975) , J. Mol. Biol. 98 (3) :503-507; Schumm, et al. (1988) , American Journal of Human Genetics 42:143-159; y Wyman, A. y White, R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 77:6754-6758.

La siguiente generaciïn de marcadores fueron variantes de tamaïo, es decir, polimorfismos de longitud, especïficamente marcadores de "repeticiones en tïndem de nïmero variable" (VNTR) (Nakamura Y., et al. (1987) , 45 Science 235: 1616-1622; y Pat. de EE.UU. Nï 4.963.663 expedida a White et al. (1990) ; Pat. de EE.UU. Nï 5.411.859, continuaciïn del documento 4.963.663 expedido a White et al. (1995) ) y los marcadores de "minisatïlites" (Jeffreys et al. (1985a) , Nature 314:67-73; Jeffreys et al. (1985b) Nature 316:76-79., Pat. de EE.UU. Nï 5.175.082 para una invenciïn de Jeffreys) . Las VNTR y los marcadores de minisatïlites contienen regiones de secuencias casi idïnticas repetidas en tïndem. La secuencia de repeticiïn central tiene una longitud de 10 a 70 bases, y las 50 secuencias de repeticiones centrales mïs cortas se denominan repeticiones "minisatïlites" y las repeticiones mïs largas se denominan VNTRs. Los diferentes individuos de una poblaciïn humana contienen nïmeros diferentes de estas repeticiones. Estos marcadores son mïs polimïrficos que los polimorfismos por sustituciïn de bases, y a veces exhiben hasta cuarenta o mïs alelos en un ïnico locus genïtico. Sin embargo, el proceso tedioso de digestiïn con enzimas de restricciïn y el anïlisis de hibridaciïn de Southern posterior todavïa son necesarios para detectar y

analizar la mayorïa de tales marcadores.

El siguiente avance implicï la uniïn de la tecnologïa de la reacciïn en cadena de la polimerasa (PCR) (Pat. de EE.UU. Nï 4.683.202 de Mullis, K.B.) con los anïlisis de loci de VNTR (Kasai K, et al. (1990) Journal Forensic Science 35 (5) :1196-1200) . Se descubrieron loci de VNTR amplificables, que se podrïan detectar sin necesidad de la transferencia de Southern. Los productos amplificados se separan por medio de geles de agarosa o poliacrilamida y se detectan mediante la incorporaciïn de radiactividad durante la amplificaciïn o mediante tinciïn posterior con plata o bromuro de etidio. Sin embargo, la PCR se puede usar solamente para amplificar de manera fiable segmentos de ADN relativamente pequeïos, es decir, para amplificar de manera fiable solamente segmentos de ADN con una longitud inferior a 3.000 bases, Ponce, M. y Micol, L. (1992) NAR 20 (3) :623; Decorte R, et al. (1990) DNA Cell Biol. 9 (6) :461-469) . Por lo tanto, se han desarrollado muy pocas VNTRs amplificables, lo que las hace, como clase, poco prïcticas para la cartografïa de ligamiento.

Con el desarrollo reciente de marcadores polimïrficos con repeticiones polimïrficas de dinucleïtidos (Litt y Luty (1989) Am J. Hum Genet 3 (4) :599-605; Tautz, D (1989) NAR 17:6463-6471; Weber y May (1989) Am J Hum Genet 44:388-396; Pat. alemana Nï DE 38 34 636 C2, inventor Tautz, D; Pat. de EE.UU. Nï 5.582.979 presentada por Weber, L.) y con repeticiones cortas en tïndem polimïrficas (STR) (Edwards, A., et al. (1991) Am. J. Hum. Genet.

49: 746-756.; Hammond, H.A., et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175-189; Fregeau, C.J.; y Fourney, R.M. (1993) BioTechniques 15 (1) : 100-119.; Schumm, J.W. et al. (1994) en The Fourth International Symposium on Human Identification 1993, pïgs. 177-187; y la Pat. de EE.UU. Nï 5.364.759 de Caskey et al.; Pat. alemana Nï DE 38 34 636 C2 de Tautz, D.) se han superado muchas de las deficiencias de los mïtodos previos. Los dos tipos de marcadores, los que contienen repeticiones de dinucleïtidos o STR (que por definiciïn incluyen repeticiones de 2-7 pb) , se denominan en general marcadores de "microsatïlites". A menudo considerados como los mejores marcadores disponibles, los loci de los microsatïlites son similares a las VNTRs amplificables, ya que sus alelos se pueden diferenciar basïndose en la variaciïn de la longitud. Sin embargo, a diferencia de las VNTRs, estos loci contienen secuencias de repeticiones perfectas o imperfectas de una longitud de dos, tres, cuatro, o raramente, cinco bases. Exhiben desde solamente unos cuantos alelos a mïs de cuarenta en un ïnico locus. Se pueden diseïar protocolos de amplificaciïn para producir productos pequeïos, en general de una longitud de 60 a 400 pares de bases, y los alelos de cada locus a menudo estïn contenidos dentro de un intervalo de menos de 50 pb. Esto permite el anïlisis electroforïtico simultïneo de varios sistemas en el mismo gel mediante el diseïo cuidadoso de los cebadores de PCR de forma que todos los productos de la amplificaciïn potencial a partir de un sistema individual no solapan... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para detectar una secuencia de ADN objetivo de repeticiones intermedias en tïndem que tiene una incidencia baja de artefactos por tartamudeo, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de ADN que tiene al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem es una regiïn del ADN que contiene al menos una unidad de repeticiïn que consiste en una secuencia de cinco (5) , seis (6) , o siete (7) pares de bases repetidas en tïndem al menos dos (2) veces; y

(b) detectar la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem en la muestra de ADN, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem de la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) 10 se amplifica antes de la etapa (b) , y en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem se amplifica mediante el uso de al menos un cebador oligonucleotïdico, que comprende una secuencia que es complementaria y que flanquea a una regiïn de un marcador de ADN bicatenario que contiene una secuencia molde de repeticiones intermedias en tïndem, en la que la secuencia molde de repeticiones intermedias en tïndem es una regiïn del marcador de ADN que contiene la secuencia de unidades de repeticiïn repetidas en tïndem al menos dos (2) veces,

con tal de que el marcador de ADN tenga la secuencia SEQ ID Nï:26.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) es ADN genïmico humano.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 2, en el que el cebador oligonucleotïdico usado en la amplificaciïn de la

secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem tiene un marcador fluorescente unido de manera covalente a ïl.

4. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs detectar los polimorfismos en la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem amplificada.

5. El mïtodo de la reivindicaciïn 4, en el que el cebador oligonucleotïdico proporcionado en la etapa (b)

comprende una secuencia seleccionada de uno de los grupos de secuencias que consisten en: SEQ ID Nï:107, SEQ ID Nï:108, SEQ ID Nï:109, SEQ ID Nï:110 y SEQ ID Nï: 111.

6. Un equipo para la detecciïn de al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem en una muestra de ADN, en el que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem es una regiïn de la muestra de ADN que contiene al menos una unidad de repeticiïn que consiste en una secuencia de cinco (5) , seis (6) , o siete (7) pares de bases repetidas en tïndem al menos dos (2) veces, y el equipo comprende:

un recipiente que tiene un par de cebadores oligonucleotïdicos para amplificar la al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tïndem, en el que cada cebador oligonucleotïdico comprende una secuencia de ïcidos nucleicos de una longitud mayor de 15 nucleïtidos, cuyas secuencias son complementarias a las cadenas opuestas de un marcador de ADN bicatenario que flanquea a la secuencia molde de repeticiones intermedias en tïndem,

y en el que el marcador de ADN tiene la secuencia SEQ ID Nï:26.

7. El equipo de la reivindicaciïn 6, que comprende ademïs el marcador de ADN.

8. Un cebador oligonucleotïdico que comprende una secuencia de una longitud mayor de 15 nucleïtidos, cuya secuencia es complementaria a una cadena de un marcador de ADN bicatenario adyacente a una secuencia molde

de repeticiones intermedias en tïndem, en el que la secuencia molde de repeticiones intermedias en tïndem es una regiïn del marcador de ADN bicatenario que contiene al menos una unidad de repeticiïn que consiste en una secuencia de cinco (5) , seis (6) , o siete (7) pares de bases repetidas en tïndem al menos dos (2) veces, en el que la secuencia del marcador de ADN bicatenario es SEQ ID Nï:26.

9. El cebador oligonucleotïdico de la reivindicaciïn 8, en el que el cebador oligonucleotïdico comprende una 45 secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID Nï:107, SEQ ID Nï:108, SEQ ID Nï:109, SEQ ID Nï:110 y SEQ ID Nï: 111.

10. Un equipo segïn la reivindicaciïn 6, en el que al menos uno del par de cebadores oligonucleotïdicos es un cebador segïn la reivindicaciïn 8 o la reivindicaciïn 9.

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

REPETICIïN DE PENTANUCLEïTIDOS POLIMïRFICA G210