Procedimiento de análisis de loci de microsatélites, que comprende las etapas de:

a) proporcionar cebadores para la co-amplificación de un conjunto de al menos nueve loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende BAT-25, BAT-26, MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046, D7S3070, D7S1808 y D10S1426;

b) co-amplificar el conjunto de loci de al menos una muestra de ADN genómico de una reacción de amplificación de multiplexado, utilizando los cebadores, produciendo así fragmentos de ADN amplificados; y

c) determinar el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados

Detección de inestabilidad de microsatélites y su utilización en el diagnóstico de tumores.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente US número 09/841,366, presentada el 24 de abril de 2001, que es una "continuation-in-part" de la solicitud de patente US número 09/663,020, presentada el 15 de septiembre de 2000.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a la detección de inestabilidad en regiones de ADN genómico que contienen repeticiones en tándem simples, tales como loci de microsatélites. La invención se refiere particularmente al análisis múltiple de la presencia o ausencia de inestabilidad en un conjunto de loci de microsatélites en ADN genómico de células, tejidos o fluidos corporales procedentes de un tumor. La invención también se refiere a la utilización de análisis de la inestabilidad de microsatélites en la detección y el diagnóstico de cáncer y la predisposición para el cáncer.

Antecedentes de la invención

Los loci de microsatélites de ADN genómico se han analizado para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo pero no limitado a, prueba de paternidad, trabajo forense, y en la detección y el diagnóstico del cáncer. El cáncer puede detectarse o diagnosticarse basándose en la presencia de inestabilidad en loci de microsatélites particulares que son inestables en uno o más tipos de células tumorales.

Un locus de microsatélites es una región del ADN genómico con repeticiones en tándem simples que son unidades repetitivas de una y cinco pares de bases de longitud. Cientos de miles de estos loci de microsatélites están dispersos por todo el genoma humano. Los loci de microsatélites se clasifican en función de la longitud de la unidad repetitiva más pequeña. Por ejemplo, los loci con unidades repetitivas de 1 a 5 pares de bases de longitud se denominan loci repetitivos "mononucleótido", "dinucleótido", "trinucleótido", "tetranucleótido", y "pentanucleótido", respectivamente.

Cada locus de microsatélites de ADN genómico normal de las especies más diploides, tal como ADN genómico de especies de mamíferos, consiste en dos alelos en cada locus. Los dos alelos pueden ser iguales o diferentes entre sí en longitud y pueden variar de un individuo a otro. Los alelos microsatélites normalmente se mantienen en una longitud constante en un individuo dado y sus descendientes; pero, se ha observado inestabilidad en la longitud de los microsatélites en algunos tipos de tumores (Aaltonen et al., 1993, Science 260:812-815; Thibodeau et al., 1993 Science 260:816-819; Peltomäki et al., 1993 Cancer Research 53:5853-5855; Ionov et al., 1993 Nature 363:558-561). Esta forma de inestabilidad genómica en los tumores, denominada inestabilidad de microsatélites (a partir de ahora, "MSI"), es un sello distintivo molecular del síndrome de cáncer hereditario heredado de cáncer colorrectal no poliposo (en lo sucesivo, "HNPCC"). La causa de la MSI en el HNPCC se cree que es un desajuste disfuncional del sistema de reparación del ADN que no logra revertir los errores que se producen durante la replicación del ADN (Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997 Nat Genetics 17:271-2). La inserción o supresión de una o más unidades repetitivas durante la replicación del ADN se mantienen sin los genes de reparación y puede detectarse como polimorfismos de longitud por comparación de los tamaños de los alelos en los loci de microsatélites amplificados a partir de muestras de ADN normal y tumoral (Thibodeau et al., 1993, supra).

La MSI se ha encontrado en más del 90% del HNPCC y en el 10-20% de los tumores colorrectales esporádicos (Liu et al., 1996 Nature Med 2:169-174; Thibodeau et al. 1993, supra; Ionov et al., 1993 Nature 363:558-561; Aaltonen et al., 1993 Science 260: 812-816; Lothe et al., 1993 Cancer Res. 53: 5849-5852). Sin embargo, la MSI no se limita a los tumores colorrectales. La MSI también ha sido detectada en el cáncer de páncreas (Han et al., 1993 Cancer Res 53:5087-5089), el cáncer gástrico (Id.; Peltomäki et al., 1993 Cancer Res 53:5853-5855; Mironov et al., 1994 Cancer Res. 54:41-44; Rhyu et al., 1994 Oncogene 9:29-32; Chong et al., 1994 Cancer Res 54:4595-4597), el cáncer de próstata (Gao et al., 1994 Oncogene 9:2999- 3003), el cáncer de endometrio (Risinger et al., 1993 Cancer Res 53:5100-5103; Peltomäki et al., 1993 Cancer Res 53:5853-5855), y el cáncer de mama (Patel et al., 1994 Oncogene 9:3695-3700).

La base genética del HNPCC se cree que es una mutación de línea germinal en uno de varios genes de reparación de errores de emparejamiento de ADN (a partir de ahora "MMR") (Leach et al., 1993 Cell 75:1215-1225; Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997 Nat Genetics 17:271-2; Papadopoulos et al., 1994 Science 263:1625-1629). Entre los pacientes del HNPCC, se ha informado que el 50-60% llevan mutaciones heredadas en los genes de reparación de errores de emparejamiento MSH2 y MLH1 (Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068:5074). Por otra parte, el 70-100% de los casos de HNPCC cuyos tumores manifiestan un fenotipo de alta frecuencia de MSI (a partir de ahora "MSI-H") presuntamente tienen mutaciones de línea germinal en estos dos genes. Pocas mutaciones de línea germinal en genes MSH6, MSH3, PMS1 y PMS2 han sido detectadas en pacientes de HNPCC, lo que indica que las mutaciones heredadas en estos genes de reparación de errores de emparejamiento juegan un papel menor en el HNPCC (Peltomäki et al., 1997 Gastroenterologly 113:1146-1158; Liu et al., 1996 Nat Med 2:169-174; Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074). Sin proteínas de reparación funcionales, los errores que producen durante la replicación no se reparan, provocando altos índices de mutación y una probabilidad aumentada de desarrollo del tumor.

El ADN repetitivo es particularmente sensible a los errores en la replicación y, por lo tanto, los sistemas de reparación de genes disfuncionales dan lugar a alteraciones generalizadas en las regiones microsatélites. Un estudio de células de levadura sin sistemas de reparación disfuncional mostró un aumento de 2800, 284, 52, y 19 veces en los índices de mutación en repeticiones de mono-, di-, tri-, tetra-, y pentanucleótido, respectivamente (Sia et al., 1997 Molecular and Cellular Biology 17:2851-2858). Las mutaciones en los genes de reparación de errores de emparejamiento no se cree que desempeñan un papel directo en la génesis de los tumores, sino que actúan permitiendo que persista la replicación de errores de ADN. La reparación de los errores de emparejamiento de las células de los genes que tienen altos índices de mutación, y si estas mutaciones se producen en los genes implicados en la tumorogénesis, el resultado puede conducir al desarrollo de cáncer. Los tumores positivos en MSI se han encontrado que llevan mutaciones de cambio de estructura somáticas en las repeticiones de mononucleótido en la región codificante de varios genes implicados en el control del crecimiento, la apoptosis y la reparación del ADN (por ejemplo, TGFBRII, BAX, IGFIIR, TCF4, MSH3, MSH6) (Planck, et al., 2000 Genes, Chromosomes & Cancer 29:33-39; Yamamoto et al., 1998 Cancer Research 58:997-1003; Grady et al., 1999 Cancer Research 59:320-324; Markowitz et al., 1995 Science 268:1336-1338; Parsons et al., 1995 Cancer Research 55:5548-5550). El locus más frecuentemente alterado es TGFBRII, en el que aproximadamente el 90% de los tumores de colon MSI-H se han encontrado que contienen una mutación en la repetición de poliadenina de base 10 presente en el gen (Markowitz et al., 1995 Science 268:1336-1338).

La MSI se produce en casi todos los tumores HNPCC independientemente de qué gen de reparación de errores de emparejamiento está implicado. La MSI también ha sido observada de forma precoz en la formación de tumores. Estos dos factores contribuyen a hacer el análisis de la MSI una prueba de diagnóstico excelente para la detección de HNPCC. Además, el análisis de la MSI puede servir como una útil prueba previa de detección para identificar los posibles pacientes de...

1. Procedimiento de análisis de loci de microsatélites, que comprende las etapas de:

a) proporcionar cebadores para la co-amplificación de un conjunto de al menos nueve loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende BAT-25, BAT-26, MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046, D7S3070, D7S1808 y D10S1426;

b) co-amplificar el conjunto de loci de al menos una muestra de ADN genómico de una reacción de amplificación de multiplexado, utilizando los cebadores, produciendo así fragmentos de ADN amplificados; y

c) determinar el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados.

2. Procedimiento de detección de inestabilidad de microsatélites en ADN genómico, que comprende las etapas de:

a) proporcionar cebadores para la co-amplificación de un conjunto de al menos nueve loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende BAT-25, BAT-26, MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046, D7S3070, D7S1808, y D10S1426;

b) co-amplificar el conjunto de loci de una primera muestra de ADN genómico procedente de material biológico normal no canceroso de una persona y de una segunda muestra de ADN genómico procedente de un segundo material biológico de la persona, en reacciones de amplificación de multiplexado separadas, utilizando al menos un cebador de oligonucleótido para cada uno de los loci de microsatélites, produciendo así unos primeros fragmentos de ADN amplificados a partir de la primera muestra y unos segundos fragmentos de ADN amplificados a partir de la segunda muestra; y

c) comparar el tamaño de los primeros fragmentos de ADN amplificado con el tamaño de los segundos fragmentos de ADN amplificados para detectar la inestabilidad en cualquiera de los loci del segundo ADN genómico.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos uno de los cebadores proporcionados en la etapa (a) tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de secuencias de cebadores identificadas por: SEQ ID NO: 1 a 68.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el conjunto de loci se co-amplifica utilizando al menos un cebador para cada locus seleccionado del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 60, cuando el locus es BAT-25,

SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, cuando el locus es BAT-26,

SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, cuando el locus es BAT-40,

SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, cuando el locus es MONO-15,

SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 59, cuando el locus es D3S2432,

SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, cuando el locus es D7S 1808,

SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, cuando el locus es D7S3070,

SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64, cuando el locus es D7S3046, y

SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, cuando el locus es D10S1426.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el conjunto de loci se co-amplifica en la etapa (b) utilizando al menos un cebador de oligonucleótido para cada locus que se marca de manera fluorescente.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el al menos una muestra de ADN genómico comprende una primera muestra de ADN genómico procedente de material biológico normal no canceroso de una persona y una segunda muestra de ADN genómico procedente de un tumor de la persona, comprendiendo también el procedimiento:

detectar la inestabilidad de microsatélites mediante la comparación del tamaño de los fragmentos de ADN amplificados producidos a partir de la co-amplificación de la primera muestra de ADN genómico en el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados producidos a partir de co-amplificación de la segunda muestra de ADN genómico.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se utilizan en el pronóstico del tumor.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se utilizan en el diagnóstico de un tumor de predisposición familiar.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los resultados de la inestabilidad de microsatélites se utilizan para detectar tumores cancerosos del sistema gastrointestinal y del endometrio.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que los tumores cancerosos son tumores de un cáncer colorrectal.

11. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la segunda muestra de material biológico se selecciona del grupo formado por: tejido tumoral, células diseminadas, heces, células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero, ganglios linfáticos, orina y otros fluidos corporales.

12. Equipo para el análisis de loci de microsatélites de ADN genómico humano, que comprende:

cebadores de oligonucleótido para la co-amplificación de un conjunto de al menos nueve loci de microsatélites de ADN genómico humano, comprendiendo el conjunto BAT-25, BAT-26, MONO-15, BAT-40, D3S2432, D7S3046, D7S3070, D7S1808, y D10S1426.

13. Equipo según la reivindicación 12, en el que al menos uno de los cebadores de oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 60, cuando el locus es BAT-25,

SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, cuando el locus es BAT-26,

SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, cuando el locus es BAT-40,

SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, cuando el locus es MONO-15,

SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 59, cuando el locus es D3S2432,

SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, cuando el locus es D7S1808,

SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, cuando el locus es D7S3070,

SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64, cuando el locus es D7S3046, y

SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, cuando el locus es D10S1426.

14. Equipo según la reivindicación 12, en el que al menos un cebador de oligonucleótido para cada uno de los al menos nueve loci de microsatélites en el conjunto se marca de manera fluorescente.

15. Equipo según la reivindicación 12, en el que el equipo comprende además una polimerasa termoestable.

16. Equipo según la reivindicación 12, en el que el equipo comprende además un primer ADN de control aislado de material biológico normal no canceroso, y el segundo ADN de control de material biológico carece de genes de reparación de errores de emparejamiento.

17. Equipo según la reivindicación 12, en el que la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites co-amplificados por los cebadores se puede utilizar en el diagnóstico de tumor de pronóstico.

18. Equipo según la reivindicación 12, en el que la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites co-amplificados por los cebadores se puede utilizar en el diagnóstico de un tumor de predisposición familiar.

19. Equipo según la reivindicación 12, en el que la inestabilidad en el conjunto de loci de microsatélites co-amplificados por los cebadores es una indicación de tumores del sistema gastrointestinal o del endometrio.

20. Equipo según la reivindicación 12, en el que la inestabilidad de microsatélites es un indicio de cáncer colorrectal.